乳腺癌BRCA1相互作用蛋白1基因功能區(qū)單核苷酸多態(tài)性與習(xí)慣性流產(chǎn)的相關(guān)性

羅 莉，魏曙光，常 遼，李生斌，趙 靜

(1. 西安交通大學(xué)附屬?gòu)V仁醫(yī)院，陜西西安 710004；2.西安交通大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061)

習(xí)慣性流產(chǎn)(recurrent miscarriages, RM)是指連續(xù)2次或2次以上的流產(chǎn)。RM的原因極其復(fù)雜，包括遺傳、免疫、解剖、內(nèi)分泌、感染等各方面的異常，且近50%的RM原因仍然不清楚，即原發(fā)性RM[1]。RM受遺傳與環(huán)境因素共同作用。家系、雙生子及寄養(yǎng)子研究表明，RM的遺傳度為40%～60%[2]。宮頸癌與乳腺癌易感基因相互作用蛋白 1(BRCA1-interactingprotein 1, BRIP1)基因在婦女相關(guān)疾病中被廣泛研究[3-5]，然而BRIP1基因與RM的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究選擇BRIP1基因5′非翻譯區(qū)(5′ untranslated region, 5′UTR)rs2048718、外顯子18(Exon)rs4986764、外顯子20 rs4986763、3′非翻譯區(qū)rs11079454共4個(gè)位點(diǎn)與RM進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組于2014年5月-2017年12月收集我院RM患者外周靜脈血291份(RM≥2)作為病例組，選擇281例正常分娩者的外周靜脈血作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：女性生殖系統(tǒng)慢性疾病或腫瘤；生殖器官畸形；有流產(chǎn)史或?qū)m外孕；神經(jīng)精神疾?。恍难芟到y(tǒng)疾??；免疫系統(tǒng)疾病；感染性疾病等。所有研究對(duì)象均為漢族，祖籍中國(guó)北方。經(jīng)知情同意采取外周靜脈血2～5 mL，-80 ℃保存待提取基因組DNA。

1.2 研究方法采用Omega Blood DNA Kit試劑盒提取基因組DNA。采用MassARRAY技術(shù)對(duì)SNP進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及基因分型。PCR反應(yīng)體系為DNA樣本5 ng/μL，PCR Buffer 0.625 μL，MgCl20.325 μL，dNTP、引物、HotstarTaq0.1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，4 ℃保存，共45個(gè)循環(huán)。延伸反應(yīng)體系為iPlex Buffer (10×)0.2 μL，iPlex Termination mix 0.2 μL，引物 0.804 μL，iPlex enzyme 0.041 μL，終體積為2 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，72 ℃ 3 min，4 ℃保存。將檢測(cè)樣品從384孔反應(yīng)板轉(zhuǎn)移到表面覆蓋基質(zhì)的MassARRAY SpectroCHIP芯片，放入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，全自動(dòng)分析。TYPER軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得分型數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析基因頻率使用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用Pearson’s卡方檢驗(yàn)；基因型及等位基因頻率在病例組及對(duì)照組中差異分析采用卡方檢驗(yàn)，優(yōu)勢(shì)比(OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)采用二元回歸。單倍型分析采用Haploview4.2軟件，單倍型頻率采用近似法進(jìn)行計(jì)算，單倍型頻率在病例組及對(duì)照組中差異分析采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)BRIP1基因rs2048718、

rs4986764、rs4986763及rs11079454位點(diǎn)對(duì)照組基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明該群體具有代表性(表1)。

2.2 病例組與對(duì)照組基因型及等位基因頻率分布BRIP1基因外顯子18 rs4986764位點(diǎn)TT、CT及CC基因型在對(duì)照組及病例組之間分布頻率不同，病例組CC基因型頻率明顯高于對(duì)照組(χ2=6.469，P=0.039)；病例組C等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(χ2=4.893，P=0.027，OR=1.330，95%CI=1.033-1.714)。rs2048718、rs4986763及rs11079454 SNP位點(diǎn)基因型與等位基因在對(duì)照組及病例組頻率分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

表1 BRIP1基因型及等位基因頻率在病例組及對(duì)照組中的分布

Tab.1 The genotype and allele frequency of BRIP1 in patients and healthy controls

位點(diǎn)位置組別MAF基因型[n(%)]Paχ2, Pb等位基因[n(%)]χ2, PcOR, 95% CITTTCCC?TCrs20487185'UTR對(duì)照組0.231163(58.21)104(37.14)13(4.64)0.482.762, 0.251430(76.79)130(23.21)0.402, 0.5261.094, 0.828-1.445病例組183(62.89)90(30.93)18(6.19)?456(78.35)126(21.65)CCCTTT?CTrs4986764Exon 18對(duì)照組0.338120(43.17)129(46.40)29(10.43)0.516.469, 0.039369(66.37)187(33.63)4.893, 0.0271.330, 1.033-1.714病例組156(53.79)108(37.24)26(8.97)?420(72.41)160(27.59)CCCTTT?CTrs4986763Exon 20對(duì)照組0329122(45.52)114(42.54)32(11.94)0.503.504, 0.173358(66.79)178(33.21)2.966, 0.0851.251, 0.969-1.613病例組155(53.45)105(36.21)30(10.34)?415(71.55)165(28.45)TTTAAA?TArs110794543'UTR對(duì)照組0.47286(30.71)132(47.14)62(22.14)0.401.616, 0.446304(54.29)256(45.71)0.169, 0.6811.050, 0.832-1.326病例組86(29.55)151(51.89)54(18.56)?323(55.50)259(44.50)

aP對(duì)照組Hardy-Wenberg平衡檢驗(yàn);bP基因型頻率組間差異統(tǒng)計(jì)結(jié)果；cP等位基因頻率組間差異統(tǒng)計(jì)結(jié)果；MAF：最小等位基因頻率分布。

2.3 單倍型頻率分布連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)有rs11079454-rs4986763-rs494986764構(gòu)成的單倍型高度連鎖(D’>0.9，r2>0.8)。對(duì)照組T-T-T單倍型頻率明顯高于病例組(χ2=8.043，P=0.005，OR=0.565，95%CI=0.381-0.840)；病例組T-C-C單倍型頻率明顯高于對(duì)照組(χ2=4.392，P=0.036，OR=1.540，95%CI=1.027-2.310)(圖1)。

圖1 BRIP1基因4個(gè)SNP位點(diǎn)連鎖不平衡結(jié)果

Fig.1 The result of linkage disequilibrium analysis of four SNPs on BRIP1

3 討 論

BRIP1是一種與乳腺癌易感基因1(breast cancer 1, BRCA)相互作用的DNA解旋酶，在基因組穩(wěn)定與DNA修復(fù)中發(fā)揮重要作用[6]。該基因在染色體上定位于17q22，編碼1 249個(gè)氨基酸，含19個(gè)內(nèi)含子、20個(gè)外顯子，基因跨度為184 kb(61679186,61864120)。研究表明，BRIP1基因與多種疾病密切相關(guān)[3-5,7-8]。然而，BRIP1基因?qū)M的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

我們選擇了BRIP1基因非翻譯區(qū)和外顯子區(qū)4個(gè)SNP位點(diǎn)。外顯子決定氨基酸的排列，有意或無(wú)意的突變均會(huì)影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列或轉(zhuǎn)錄效率，從而影響蛋白質(zhì)的功能。研究發(fā)現(xiàn)，第3個(gè)核苷酸可以影響翻譯的效率，原來(lái)在氨基酸表達(dá)翻譯時(shí)，其密碼子的優(yōu)先度不一樣。原核和真核生物在表達(dá)翻譯時(shí)，同一氨基酸翻譯時(shí)優(yōu)先的密碼子也不同。因此，如果外顯子區(qū)域發(fā)生的基因突變，即使沒(méi)有改變蛋白的序列，也很有可能改變了其翻譯的效率[9]。非翻譯區(qū)雖然不是構(gòu)成該基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，但在5′非翻譯區(qū)內(nèi)的上游可讀框可以被翻譯成多肽。5′UTR可能含有以下調(diào)控序列：①蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，這可能會(huì)影響mRNA的穩(wěn)定性或翻譯；②核糖開關(guān)；③促進(jìn)或抑制翻譯起始的序列；④5′UTR的內(nèi)含子與調(diào)控基因表達(dá)和mRNA出核轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。3′UTR在mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定性和翻譯調(diào)節(jié)中起重要作用。

本研究結(jié)果顯示，BRIP1基因外顯子18 rs4986764病例組CC基因型頻率明顯高于對(duì)照組，病例組C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組。該結(jié)果提示，BRIP1基因rs4986764位點(diǎn)C等位基因?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)因子，攜帶有C等位基因的個(gè)體可能更容易患RM。本研究首次表明BRIP1基因與RM具有相關(guān)性。但BRIP1基因在乳腺癌、卵巢癌等其他女性相關(guān)疾病中的作用已有廣泛研究。例如，REN 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者rs4986764位點(diǎn)C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組；LIU等[11]對(duì)18項(xiàng)研究包括中國(guó)13 716個(gè)癌癥患者及15 590個(gè)健康對(duì)照個(gè)體的BRIP1基因rs4986764位點(diǎn)進(jìn)行meta分析表明，rs4986764位點(diǎn)與降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。這些研究表明，rs4986764位點(diǎn)變異很可能影響B(tài)RIP1基因功能，進(jìn)而影響多種女性相關(guān)疾病易感性。本研究的單倍型分析結(jié)果顯示，rs11079454-rs4986763-rs494986764構(gòu)成的T-T-T單倍型對(duì)照組頻率明顯高于病例組，病例組T-C-C單倍型頻率明顯高于對(duì)照組，表明T-T-T為保護(hù)單倍型，而T-C-C為風(fēng)險(xiǎn)單倍型，進(jìn)一步支持了BRIP1基因rs4986764位點(diǎn)C等位基因?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)因子。

綜上所述，本研究表明，BRIP1基因外顯子18的rs4986764位點(diǎn)與RM有關(guān)，CC基因型是RM的易感位點(diǎn)，但關(guān)于該多態(tài)性位點(diǎn)如何調(diào)控BRIP1基因的表達(dá)水平，以及對(duì)RM發(fā)生機(jī)制的影響，還需進(jìn)一步研究。