EZH2、MMP-2及MMP-9在肝癌侵襲轉移中的作用及關系

張淑群，張 瑩，楊 鑫，王敏聰，韓麗麗

(1. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤病院；2. 西安交通大學組織部；3. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，陜西西安 710004)

原發(fā)性肝癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)是世界范圍內(nèi)的第5大腫瘤[1]，也是我國常見的惡性腫瘤，嚴重威脅人民的健康[2]。由于HCC起病隱匿、侵襲轉移能力強、疾病發(fā)展迅速，大多數(shù)患者確診時已處于晚期，喪失了手術時機?；?、放療或介入治療在HCC中的應用均比較局限。探索、篩選與HCC侵襲轉移相關的有效生物標記物，明確HCC侵襲轉移機制對提高HCC預后至關重要，普遍引起人們關注。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)家族是一系列降解細胞外基質(zhì)的重要肽鏈內(nèi)切酶酶類，參與多種人類腫瘤的侵襲轉移[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是由肝細胞分泌，通過破壞分解細胞外基質(zhì)促進腫瘤的生長、浸潤和轉移[4-5]。果蠅zeste基因增強子的人類同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)具有DNA甲基轉移和組蛋白脫乙?；傅恼{(diào)控作用，調(diào)控癌癥進展和干細胞的多潛能性等生命活動[6-9]。在肝癌中EZH2表達也有明顯升高，其過表達與肝癌患者的復發(fā)和預后不良密切相關[10]，但EZH2在肝癌侵襲轉移中發(fā)揮的作用尚需闡明，并且EZH2在肝癌組織中與MMP-2、MMP-9的關系目前尚不清楚。故本研究檢測EZH2、MMP-2、MMP-9在肝癌組織中的表達情況及在HCC中的臨床病理價值，并分析EZH2與MMP-2、MMP-9表達的相關性，以及EZH2對肝癌細胞侵襲的影響，明確EZH2是否通過MMP-2、MMP-9發(fā)揮調(diào)控肝癌侵襲轉移作用，從而更好地理解肝癌侵襲轉移機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象及組織標本隨機選擇2010年3月至2011年3月在西安交通大學第二附屬醫(yī)院接受外科切除術的原發(fā)性肝癌患者120例。納入標準：①臨床及病理資料完整；②術前未接受放化療；③無嚴重肝腎疾?。虎芪春喜⑵渌[瘤；⑤所有組織標本均經(jīng)病理醫(yī)師檢查證實。外科切除手術標本，包括新鮮的肝癌組織和配對的癌旁組織樣本(距離邊緣2 cm)，術中切除后立即保存在液態(tài)氮中，以備后續(xù)研究。

1.2 qRT-PCR法檢測EZH2、MMP-2和MMP-9的表達應用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取HCC組織及癌旁組織或HCC細胞中總RNA，利用紫外分光光度計檢測RNA濃度；將RNA反轉錄為cDNA(反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司)。qRT-PCR條件：95 ℃預熱15 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 8 s，重復40個周期。EZH2、MMP-2及MMP-9相對表達采用2-△△Ct法對比GAPDH表達進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗重復3次。EZH2、MMP-2及MMP-9引物購自TaKaRa公司，引物序列如表1所示。

表1 EZH2、MMP-2、MMP-9和GAPDH引物序列

Tab.1 Primer sequences of EZH2, MMP-2, MMP-9 and GAPDH for qRT-PCR analysis

Gene Forward primer (5'-3') Reverse primer (5'-3')EZH2GTGGAGAGATTATTCTCAAGATGCCGACATACTTCAGGGCATCAGCCMMP-2GATACCCCTTTGACGGTAAGGACCTTCTCCCAAGGTCCATAGCMMP-9TTGACAGCGACAAGAAGTGGGCCATTCACGTCGTCCTTATGAPDHCCATCTTCCAGGAGCGAGATCGCCTTCTCCATGGTGGTGAA

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染SMMC-7721細胞培養(yǎng)人肝癌細胞株和LO2細胞購自美國ATCC生物資源中心。應用含150 mL/L胎牛血清(四季青公司)的DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher)培養(yǎng)細胞，1.25 g/L胰酶消化細胞進行傳代，3 d傳代1次。

小干擾RNA由上海吉凱制藥技術有限公司合成，針對EZH2基因提供3個靶點供篩選：

Target1：5′-CCAGGACACGAGGAAACUG-3′ 5′-AAAUCUCGGUGCACUAGGA-3′

Target2：5′-GCACCAGUCCAGUAUUGGC-3′ 5′-CGAGACUUCUGCGGAUUGC-3′

Target3：5′-GAUGCAGUUCCGCUCCAUU-3′ 5′-GGCUUUUGUCCCAGCCAUC-3′

1.4 Transwell小室實驗測定細胞遷移、侵襲Transwell遷移實驗：重懸2×104個肝癌細胞接種于Transwell小室上層，加入100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，設3個復孔；Transwell小室下層加入500 μL含150 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后吸出上室內(nèi)培養(yǎng)基，輕輕用棉簽拭去小室上層未遷移過膜的肝癌細胞；固定細胞15 min，結晶紫染色30 min；室溫風干過夜，于光鏡下隨機觀察10個視野計數(shù)。

Transwell侵襲實驗：按照3∶1比例用無血清DMEM稀釋Matrigel膠，每小室取100 μL稀釋好的膠鋪滿上層，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育6 h；余步驟同遷移實驗。

1.5 統(tǒng)計學分析應用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。兩組間差異用獨立樣本t檢驗進行比較。EZH2、MMP-2及MMP-9與臨床病理參數(shù)的關系采用Logistic回歸進行分析。EZH2與MMP-2、MMP-9相關性首先應用TCGA公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行分析，然后應用Pearson相關分析120例臨床組織標本中EZH2與MMP-2、MMP-9表達的相關性。本研究先對EZH2、MMP-2及MMP-9在HCC中表達進行t檢驗，根據(jù)cutoff值分別分成高、低表達組進行進一步研究。比較3種小干擾RNA在SMMC-7721細胞系中對EZH2表達抑制作用先采用方差分析，并進行兩兩比較。雙側P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 研究對象的基本情況臨床及病理資料完整的肝癌組織以及配對癌旁組織標本120例?；颊吣挲g34～66歲，平均(45.15±10.73)歲；其中男性患者97例，女23例；甲胎蛋白(AFP)<400 ng/mL患者99例，AFP≥400 ng/mL 21例；中/高分化49例，低分化-未分化71例；腫瘤數(shù)目為單個的患者77例，腫瘤數(shù)目為多個的患者43例；腫瘤大小<5 cm患者53例，腫瘤大小≥5 cm患者67例；無微血管侵犯39例，有微血管侵犯81例；Ⅰ～Ⅱ期患者76例，Ⅲ～Ⅳ期44例。

2.2 EZH2和MMP-2、MMP-9在HCC和配對癌旁組織中的表達情況qRT-PCR檢測結果顯示，EZH2在70.8%(85/120)HCC組織中表達高于癌旁對照組織，EZH2在HCC組織的相對表達水平為5.26±0.35，而在癌旁組織中相對表達水平為2.56±0.28，EZH2在HCC組織中表達高于癌旁組織(P<0.001，圖1A)；MMP-2在63.53%(76/120)的HCC患者中表達高于癌旁對照組織，MMP-2在HCC組織中表達(4.58±0.29)高于癌旁組織(2.02±0.18，P=0.013，圖1B)；MMP-9在66.7%(80/120)的HCC患者中表達高于癌旁對照組織，MMP-9在HCC組織中表達水平(5.56±0.32)高于癌旁組織(2.71±0.24，P=0.021，圖1C)。

圖1 EZH2、MMP-2和MMP-9在肝癌組織中均高表達

Fig.1 EZH2, MMP-2 and MMP-9 were increased in HCC tissues

與癌旁組織比較，**P<0.01。

2.3 EZH2、MMP-2和MMP-9表達與HCC臨床病理參數(shù)的關系在HCC組織中EZH2表達與年齡、性別、腫瘤數(shù)目及腫瘤大小無關，但與AFP水平、腫瘤病理分級、微血管侵犯及臨床分期密切相關。HCC組織中EZH2的表達，臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期患者高于Ⅰ、Ⅱ期患者(OR=0.197，P=0.002)；有微血管侵犯的HCC患者高于沒有微血管侵犯的患者(OR=2.077，P<0.001)；AFP≥400 ng/mL者高于AFP<400 ng/mL的患者(OR=3.437，P=0.013)；病理分級為低分化-未分化的高于中/高分化患者(OR=0.553，P=0.001，表2)。

MMP-2在HCC組織中的表達與年齡、性別、AFP水平、腫瘤大小、腫瘤分期無明顯相關，但與微血管侵犯、腫瘤數(shù)目及病理分級密切相關。相比于無微血管侵犯、腫瘤數(shù)目為單個及病理分級好的HCC組織，MMP-2在有微血管侵犯(OR=2.530，P=0.023)、腫瘤數(shù)目為多個(OR=2.963，P=0.008)及病理分級差(OR=2.400，P=0.032，表2)的HCC組織中高表達。

MMP-9在HCC組織中的表達與年齡、性別、AFP水平、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小均無關，但與臨床分期、微血管侵犯及病理分級密切相關。相比于臨床分期在Ⅰ、Ⅱ期，無微血管侵犯及病理分級好的HCC組織，MMP-9在臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期(OR=0.057，P<0.001)、有微血管侵犯(OR=0.171，P<0.001)及病理分級差(OR=0.429，P=0.034，表2)的HCC組織中高表達。EZH2、MMP-2和MMP-9與肝癌微血管侵犯均有相關性，說明三者均在肝癌侵襲轉移中發(fā)揮重要作用。

表2 EZH2、MMP-2和MMP-9表達與HCC臨床病理特征的相關性

Tab.2 Association of EZH2, MMP-2 and MMP-9 expressions with clinicopathological features in HCC

臨床病理特征nEZH2低表達高表達ORPMMP-2低表達高表達ORPMMP-9低表達高表達ORP年齡(歲)2.120 0.0830.9070.830?1.892 0.122 <5049103910161237 ≥5071254634602843性別1.2080.7180.7850.8781.0880.868 女23617914715 男97296835623365AFP(ng/mL)3.4370.013*0.4180.7190.2810.634 <40099247531482850 ≥40021111013281230病理分級0.5530.001#2.4000.032*0.4290.034* 中/高分化49222712362024 低分化-未分化71135832402056腫瘤數(shù)目1.3770.3932.9630.008#0.9450.891 單個77255212402753 多個43103332361327腫瘤大小(cm)0.2640.6590.7160.4020.6000.818 <553173630461735 ≥567194814302345微血管侵犯2.077<0.001#2.5300.023*0.171<0.001# 否39271212372315 是8187332391765臨床分期0.1970.002#0.7110.3870.057<0.001# Ⅰ～Ⅱ期76304629443341 Ⅲ～Ⅳ期445391532739

*P<0.05，#P<0.01。

2.4 TCGA數(shù)據(jù)庫中EZH2和MMP-2、MMP-9表達的相關性分析TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析顯示，EZH2和MMP-2表達無相關性(r=-0.052，P=0.315，圖2A)，而與MMP-9表達存在相關性(r=0.288，P<0.001，圖2B)。

2.5 HCC組織中EZH2和MMP-2、MMP-9表達的相關性分析對120例患者HCC組織中EZH2和MMP-2、MMP-9表達進行Pearson相關性分析，其結果與TCGA數(shù)據(jù)庫分析結果一致：EZH2和MMP-2表達在統(tǒng)計學上沒有明顯的相關性(r=0.126，P=0.172，圖3A)，而與MMP-9表達水平呈正相關，具有統(tǒng)計學意義(r=0.598，P<0.001，圖3B)。

2.6 轉染小干擾RNA下調(diào)SMMC-7721細胞中EZH2表達qRT-PCR檢測原發(fā)性肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H、Bel-7402及正常肝細胞LO2中EZH2表達，結果顯示，EZH2在SMMC-7721細胞中表達最高(圖4A)。轉染EZH2-siRNA完成24 h后qRT-PCR檢測篩選3個小干擾RNA中最佳靶點，選擇干擾效果最佳3號小干擾RNA轉染SMMC-7721細胞系(P<0.01,圖4B)。qRT-PCR檢測轉染3號小干擾RNA后24、48、72 h EZH2的mRNA表達水平，結果顯示，轉染24 h開始EZH2的mRNA表達水平與對照組比較明顯下降，轉染48 h EZH2進一步降低，轉染72h EZH2表達趨于穩(wěn)定(圖4C)。

圖2 利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析EZH2與MMP-2、MMP-9相關性

Fig.2 The correlation between EZH2 and MMP-2, EZH2 and MMP-9 was analyzed by TCGA database

圖3 在HCC臨床組織中檢測分析EZH2與MMP-2、MMP-9相關性

Fig.3 The correlation of EZH2 with MMP-2 and MMP-9 in HCC tissues was analyzed by Pearson correlation analysis

圖4 轉染小干擾RNA下調(diào)SMMC-7721細胞中EZH2表達

Fig.4 Down-regulated expression of EZH2 in SMMC-7721 cells

A：肝癌細胞系和LO2細胞中EZH2表達；B：3號小干擾RNA抑制EZH2明顯；C：qRT-PCR結果顯示小干擾RNA轉染SMMC-7721細胞24、48、72 h后EZH2表達。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.7 EZH2表達下調(diào)對肝癌細胞侵襲和遷移能力的影響Transwell小室結果顯示，與對照組(SMMC-7721-NC)相比，抑制EZH2表達的SMMC-7721細胞侵襲和遷移細胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖5)。

2.8 肝癌細胞中EZH2對MMP-2，MMP-9表達的影響qRT-PCR結果顯示，與對照組(SMMC-7721-NC)比較，EZH2表達下調(diào)明顯抑制MMP-9表達水平(P<0.01，圖6)，但對MMP-2表達無明顯影響。結合臨床組織標本檢測的結果，提示EZH2可能通過促進MMP-9表達調(diào)控肝癌侵襲和轉移。

3 討 論

本研究首次揭示EZH2與MMP-2、MMP-9在肝癌組織中表達的相關性，通過分析EZH2，MMP-2和MMP-9在HCC中的臨床病理價值，初步探討了EZH2、MMP-2和MMP-9與HCC發(fā)生發(fā)展的關系。原發(fā)性肝癌是一種預后較差的惡性腫瘤，其5年生存率不足5%。一方面，由于HCC早期通常無典型臨床表現(xiàn)，生長發(fā)展迅速，大多數(shù)患者確診時已處于晚期，喪失了手術時機；而另一方面，由于HCC高侵襲和轉移的特性，導致HCC患者在手術治療后較短時間即發(fā)生復發(fā)和轉移，從而HCC預后不良。EZH2是polyeomb group(PcG)基因家族的核心成員，與其他PcG成員蛋白共同組成PRC2核心復合物，從而發(fā)揮組蛋白甲基轉移酶活性，催化組蛋白甲基化修飾[11]。EZH2同樣是新近發(fā)現(xiàn)的與人類惡性腫瘤發(fā)生密切相關的重要癌基因，目前已在多種癌細胞中檢測到了EZH2的過表達或突變,并且其變化與膽囊癌、卵巢癌、乳腺癌等多種癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關[12-14]。本研究結果表明，同癌旁正常肝組織相比，EZH2在HCC組織內(nèi)呈高表達。更重要的是，本研究結果證實在HCC組織中EZH2表達與AFP水平、腫瘤病理分級、微血管侵犯及臨床分期密切相關。進一步提示EZH2在肝癌發(fā)生發(fā)展，尤其是侵襲轉移中發(fā)揮重要作用。

圖5 轉染EZH2-siRNA明顯抑制SMMC-7721細胞遷移和侵襲Fig.5 Deletion of EZH2 inhibited SMMC-7721 invasion and migration與對照組SMMC-7721-NC細胞相比,**P<0.01。

圖6 SMMC-7721細胞中下調(diào)EZH2對MMP-2和MMP-9的影響

Fig.6 Decreased EZH2 inhibited MMP-9 expression but not MMP-2 expression

MMP-2、MMP-9屬于MMPs家族成員Ⅳ型膠原酶，核心功能是分解基底膜膠原和明膠[15-17]，在惡性腫瘤侵襲轉移過程中發(fā)揮重要作用。WANG等[18]證實了MMP-2在肝癌組織和正常肝組織中表達存在明顯差異性，MMP-2與HIF-1α協(xié)同作用與原發(fā)性肝細胞癌發(fā)生發(fā)展密切相關。MMP-9與S100A4、miR155-SOCS1共同構成作用軸促進HCC轉移[19]。我們的數(shù)據(jù)支持這些研究結果：同癌旁正常肝組織相比，MMP-2、MMP-9在HCC組織內(nèi)呈高表達；進一步分析結果顯示，MMP-2在HCC組織中與微血管侵犯、腫瘤數(shù)目及病理分級密切相關，MMP-9在HCC組織中的表達與臨床分期、微血管侵犯及病理分級密切相關。提示MMP-2和MMP-9表達升高和原發(fā)性肝癌的發(fā)生，轉移和侵襲密切相關。

值得注意的是，本研究還暗示了EZH2很可能通過MMP-9而不是MMP-2參與HCC轉移過程。既往研究提示，EZH2通過誘導H3K27三甲基及啟動子甲基化，在轉錄水平上調(diào)控下游基因E-cadherin、P16INK4和p57等基因異常表達[20-22]，促進惡性腫瘤發(fā)展，并且與惡性腫瘤侵襲和轉移密切相關。VARAMBALLY等[23]報道，在轉移前列腺癌中EZH2表達明顯上調(diào)。EZH2還被證實通過沉默p57表達促進乳腺癌轉移[24]。既往研究雖然提示EZH2與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關[25]，但回顧文獻對于EZH2如何在HCC侵入遷移過程中發(fā)揮作用尚存在疑問。MMPs家族成員中，MMP-2、MMP-9通過破壞基底膜屏障和對細胞外基質(zhì)的改造促進HCC新生血管的生成，從而促進HCC的侵襲和遷移。在本研究中發(fā)現(xiàn)，HCC組織中EZH2表達上調(diào)與MMP-2在HCC中的表達水平無明顯相關性，而與MMP-9較高表達水平密切相關。細胞學實驗同樣證實了EZH2表達變化不影響MMP-2表達，但可以影響MMP-9表達。這些結果提示我們EZH2可能通過MMP-9而不是MMP-2發(fā)揮促進HCC遷移和侵襲的作用。EZH2與MMP-9可能協(xié)同促進HCC的發(fā)生發(fā)展，但是二者間相互調(diào)控機制尚需進一步的研究證實。

綜上所述，HCC組織中EZH2、MMP-2和MMP-9呈高表達，三者表達上調(diào)均與HCC患者微血管侵犯及病理分級相關，提示EZH2、MMP-2和MMP-9參與HCC的分化和轉移。此外，EZH2表達與HCC患者AFP水平及臨床分期密切相關；MMP-2與腫瘤數(shù)目相關；MMP-9與臨床分期密切相關，進一步提示三者在HCC發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。Transwell小室實驗證實了EZH2可促進肝癌細胞侵襲和遷移。相關性分析提示在HCC組織中EZH2與MMP-2無明顯相關，而與MMP-9表達密切相關；EZH2在肝癌細胞中影響MMP-9表達，但不影響MMP-2表達。這些結果為篩選新的HCC有效的生物標記物及潛在治療靶點提供了前期的實驗依據(jù)。