CTC檢測在胃癌結(jié)直腸癌預(yù)后評估中的價值及差異性分析

趙 琳，劉醫(yī)輝，董春慧，張文文，段學(xué)琴，劉錫枝，陳 玲

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，陜西西安 710061；2. 寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，寧夏銀川 750000；3. 西安市第九醫(yī)院腫瘤科 陜西西安 710054)

早期、精準(zhǔn)檢測和判斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展對疾病的診斷治療具有重要的指導(dǎo)意義。1896年ASHWORTH[1]發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血、骨髓、淋巴結(jié)中存在的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)，在一定的條件下增殖浸潤，引起腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。胃癌結(jié)直腸癌患者術(shù)后死亡的主要原因為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，目前認(rèn)為循環(huán)腫瘤細胞是引起腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，而這不能通過普通的影像學(xué)及血液學(xué)檢測手段發(fā)現(xiàn)。糖類抗原19-9(CA19-9)、癌胚抗原(CEA)等血清學(xué)腫瘤指標(biāo)雖有一定的預(yù)測價值，但結(jié)果也僅能作為參考[2]。近年來隨著生物實驗技術(shù)的進步，液體活檢進入了臨床實踐中，應(yīng)用于腫瘤的早期診斷、預(yù)后監(jiān)測、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、個體化治療和療效評估等方面[3]。多項研究表明，測量CTC可作為一種“液體活檢”，對癌癥患者能夠進行實時無創(chuàng)、頻繁地監(jiān)測其治療反應(yīng)[4-6]。液體活檢用于檢測的循環(huán)腫瘤細胞，使精準(zhǔn)判斷腫瘤預(yù)后的設(shè)想成為可能。本研究分析了32例胃癌、36例結(jié)腸癌CTC檢測結(jié)果，并進行了差異比較，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年1月至2016年6月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實為結(jié)直腸癌36例、胃癌32例，其中男性41例、女性27例，年齡23～74(平均年齡57.43)歲。隨訪時間截止于2019年8月，所有病例隨訪時長為30個月。

1.2 循環(huán)腫瘤細胞的檢測方法

1.2.1標(biāo)本采集 嚴(yán)格消毒后，取肘正中靜脈血4 mL。所有血樣加入檸檬酸葡萄糖抗凝劑真空采血管，室溫(15～30℃)保存，且在24 h內(nèi)進行富集處理。

1.2.2密度梯度離心法富集 試劑盒采用人外周血白細胞去除試劑盒+熒光原位雜交試劑盒(江蘇萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司)。取4 mL全血至50 mL離心管中，補充CS1至45 mL。離心(650 g，室溫，5 min)，沉淀細胞加CS2至45 mL，離心(650 g，室溫，5 min)，沉淀細胞后補加CS1至5 mL。吸取150 μL磁微?；鞈乙海? mL CS1，重復(fù)洗滌3次后，用CS1重懸磁微粒至100 μL。按每份100 μL的比例將磁微粒緩慢加入前續(xù)處理好的樣本中。于50 mL離心管中加入3 mL CS3，將加入磁微粒中的所有液體輕輕疊加到CS3頂層，離心(300 g，室溫，5 min)。輕柔吸取最上2層溶液，加CS1至14 mL，離心(950 g，室溫，5 min)，棄上清至300 μL，加入1 mL CS1，靠于磁力架上2～3 min，離心(2 070 g，室溫，3 min)，棄上清至100 μL，加入100 μL CF1固定液，涂片至20 mm×20 mm的標(biāo)本框中。

1.2.3免疫熒光法染色 取CF2固定液200～300 μL完全覆蓋標(biāo)本區(qū)域，室溫固定8 min。吸去標(biāo)本區(qū)上的CF2固定液，放入已預(yù)熱的染色缸I中靜置10 min。標(biāo)本載玻片依次在染色缸中靜置2 min，室溫晾干。取探針前離心(1 000 r/min)，輕輕吹打混勻3次，并在液面處吸取。每個標(biāo)本區(qū)加入10 μL CEP8探針，蓋上蓋玻片。吸取Rubber Cement 200～300 μL，完全封住蓋玻片邊緣進行雜交：變性76 ℃ 5 min；雜交37 ℃ 1.5 h后洗片。按每人份20 μL CD45-AF594熒光抗體、180 μL 20 g/L BSA溶液的比例配制抗體工作液，避光待用。用2 g/L BSA洗標(biāo)本區(qū)2次，每次300 μL。吸去標(biāo)本區(qū)上的2 g/L BSA，將配置好的抗體加至標(biāo)本區(qū)，室溫并避光孵育1 h。將DAPI管離心(1 000 r/min)后，液面處取10 μL DAPI染液，加至標(biāo)本區(qū)，蓋上蓋玻片，鏡下觀察或置于2～8 ℃環(huán)境下避光保存。

1.2.4典型CTCs的判定標(biāo)準(zhǔn) ①單個細胞，核質(zhì)均勻，未發(fā)現(xiàn)分層；②信號3個或3個以上，且在細胞核上；③紅色通道下未見CD45顯色；④細胞表面無磁珠。 經(jīng)過鑒定符合上述標(biāo)準(zhǔn)的細胞，可以認(rèn)為是上皮細胞組織來源的腫瘤細胞，即CTCs。本實驗中將CD45(-)、細胞數(shù)>1個視為CTCs陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗對計數(shù)資料組間率的差異進行比較，當(dāng)有20%以上格子的期望頻數(shù)小于5，或有任意一個格子的期望頻數(shù)小于1，或總例數(shù)(n)<40時采用Fisher確切概率法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CTCs檢測結(jié)果判讀胃癌和結(jié)直腸癌進行了染色體熒光探針標(biāo)記，胃癌采用CEP8、CEP17標(biāo)記，結(jié)直腸癌采用CEP8、CEP7標(biāo)記(圖1)。

2.2 胃癌和結(jié)直腸癌患者術(shù)后CTCs檢測結(jié)果和生存差異胃癌組患者外周血中檢出CTCs<2組有8例(25%)，隨訪30個月后，全部患者存活；檢出CTCs≥2組有24例(75%)，隨訪30個月后，僅有8例存活，兩組的生存差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。在結(jié)直腸癌組患者中外周血檢出CTCs<2組共28例(78%)，隨訪時間結(jié)束時，全部患者存活，檢出CTCs≥2組有8例(22%)，其中6例患者在隨訪終點時間存活，結(jié)直腸癌中CTCs<2組與CTCs≥2組的生存差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.044)。胃癌與結(jié)直腸癌患者的生存差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000，表1)。

圖1 CTCs的免疫熒光染色

Fig.1 Immunofluorescence staining of circulating tumor cells (CTCs)

A: CEP8 triploid, CD45(-), Dapi(+) (×40); B: CEP17 triploid, CD45(-), Dapi(+) (×40); C: CEP8 triploid/17 triploid, CD45(-), Dapi(+) (×40)。

表1 胃癌與結(jié)直腸癌患者不同CTCs檢測表達值與生存差異

Tab.1 Differences in CTCs expression and survival in gastric cancer and colorectal cancer

組別存活死亡P胃癌0.001* <280 ≥2816 合計1616結(jié)直腸癌0.044* <2280 ≥262 合計3420.000#

*：同一癌種組內(nèi)生存率比較；#：胃癌與結(jié)直腸癌生存率比較。

2.3 CTCs與胃癌結(jié)直腸癌的臨床病理特征的關(guān)系CTCs≥2與胃癌患者的年齡、性別、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度、脈管侵犯與否均無關(guān)(P>0.05，表2)。結(jié)直腸癌患者中結(jié)果相同(P>0.05，表3)。

3 討 論

胃癌和結(jié)直腸癌的高發(fā)病率、高死亡率迫切需要早期診斷、預(yù)后監(jiān)測的靈敏便捷方法進行跟蹤[7-8]。

隨著精準(zhǔn)治療的推進，液體活檢在科研的基礎(chǔ)上，極大推進了臨床實踐的精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展。CTCs代表原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的表型和遺傳型。在血液學(xué)傳播、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)、循環(huán)腫瘤微栓塞(CTM)和CTCs的腫瘤啟動能力等方面成為CTCs的研究的熱點。

影響CTC分析的主要原因是CTC在血液里含量極微，在癌癥患者的血液中檢測到CTCs，其濃度非常低，每5×109紅細胞有1個細胞，白細胞為5～10×106個[9]。因此，對CTC的檢測技術(shù)要求較高，檢測并計數(shù)惡性腫瘤產(chǎn)生的CTC需要非常靈敏和特異的方法，故檢測非常困難?，F(xiàn)在檢測CTC的技術(shù)有很多種，主要包括 CTC 富集和鑒定技術(shù)[10]。富集技術(shù)主要基于其物理或生物學(xué)特性與血液中其他細胞的不同而實現(xiàn)。富集方法主要包括密度梯度離心、免疫磁珠分選、芯片富集技術(shù)等，其中免疫磁珠分選法因其分選特異性高，且富集到的CTC活性較好，故目前大多數(shù)檢測都采用此法[11]。鑒定技術(shù)則普遍基于腫瘤細胞表面抗原的表達，上皮細胞粘附分子(EpCAM)和細胞角蛋白(CK)是CTC鑒定中最常用的標(biāo)記物。2004年FDA批準(zhǔn)用于臨床CellSearch技術(shù)，依賴于細胞表面EpCAM的表達，易出現(xiàn)漏檢。本實驗采用陰性富集技術(shù)，利用外周血粒細胞表達白細胞表面共同抗原CD45，與磁珠結(jié)合后去除無關(guān)細胞，間接富集CTC。本法不依賴腫瘤細胞表面抗原的表達，適用的腫瘤類型較廣，其回收率達90%以上。同時采用imFISH技術(shù)，將免疫熒光檢測與熒光原位雜交技術(shù)結(jié)合對CTCs進行檢測，其不僅改進了傳統(tǒng)FISH的繁雜操作，又保護了胞內(nèi)外抗原；既保留了免疫細胞化學(xué)檢測，又實現(xiàn)了從核酸水平對細胞進行定位、定性和定量分析。

表2 胃癌患者不同臨床病理特征與CTCs陽性率的相關(guān)性

Tab.2 Correlation between clinicopathological features and positive rates of CTCs in patients with gastric cancer

病理特征總例數(shù)CTCs<2≥2χ2P年齡(歲) <601468 ≥60188100.0080.607性別 男21714 女11560.4530.383TNM分期 Ⅰ～Ⅱ1495 Ⅲ～Ⅳ187112.0320.143淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陽性826 陰性243191.0150.275遠距離轉(zhuǎn)移 M019109 M1133102.7950.095組織分化程度 分化差1468 分化良好188100.0080.607

表3 結(jié)直腸癌患者不同臨床病理特征與CTCs陽性率的相關(guān)性

Tab.3 Correlation between clinicopathological features and positive rates of CTCs in patients with colorectal cancer

病理特征總例數(shù)CTCs<2≥2χ2P年齡(歲) <601486 ≥602212100.0230.577性別 男20128 女16790.9420.263TNM分期 Ⅰ～Ⅱ1457 Ⅲ～Ⅳ227150.3300.417淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陽性1064 陰性2612140.5540.356遠距離轉(zhuǎn)移 M0251312 M111381.8920.156組織分化程度 分化差17710 分化良好191181.0030.253

DNA異倍體是染色體異常的表型，也是細胞癌變的特征指標(biāo)，與惡性腫瘤的異常增殖相關(guān)。一般來說，在染色體水平鑒定循環(huán)腫瘤細胞(CTC)更為客觀及準(zhǔn)確。由于腫瘤細胞的異質(zhì)性，同一患者組織來源的腫瘤細胞可能會出現(xiàn)多種染色體不穩(wěn)定的情況；另外同一細胞的染色體倍體檢測中也會出現(xiàn)多條染色體倍體異常的情況。本研究采用的是染色體著絲粒探針，在檢測過程中出現(xiàn)同一腫瘤細胞會出現(xiàn)兩種染色體異倍體分別存在或共存的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中17號染色體多體與遠端轉(zhuǎn)移存在顯著的相關(guān)性[12]；8號染色體擴增的CTC在進展期胃癌具有較高的檢出率[13]；結(jié)直腸癌中存在8號染色體和7號染色體擴增情況[14]。

目前CTC最為成熟的應(yīng)用是對局部或者轉(zhuǎn)移性腫瘤預(yù)后的評估，其實用性已得到證實；而簡便、可反復(fù)檢測的特點亦使其在動態(tài)療效評估中具有較大的應(yīng)用潛力。TIEN等[15]發(fā)現(xiàn)門靜脈中的CTC數(shù)量也可作為肝轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測因素。胃癌和結(jié)直腸癌預(yù)后有明顯差異，雖然化療和靶向治療方法不斷改進，但胃癌對諸多療法不敏感，是導(dǎo)致其預(yù)后差的主要原因，早期檢測明確預(yù)后，積極治療是提高腫瘤患者生存率的有效方法。HIRAIWA等[16]對130例胃腸道癌患者和41例健康志愿者進行研究，其中包括44例胃癌患者，結(jié)果顯示27例轉(zhuǎn)移性胃癌患者的CTC計數(shù)高于14例非轉(zhuǎn)移性胃癌患者。另一項研究包括136例晚期胃癌患者，表明CTC的出現(xiàn)是較短PFS的獨立預(yù)測因子[17]。LI等[18]研究發(fā)現(xiàn)，CTC的非整倍性與進展期胃癌患者預(yù)后相關(guān)，定量比較監(jiān)測治療前后多形CTC有助于預(yù)測預(yù)后的改善或惡化以及化療耐藥性。

LI等[19]應(yīng)用imFISH分析技術(shù)在肺癌、胃癌、乳腺癌及食管癌中研究發(fā)現(xiàn)，以CTCs≥2為分界值時，腫瘤檢出的陽性率依次為71.33%、86.21%、76.77%和78.35%，具有較高的靈敏度，且假陽性相對較低。本研究結(jié)果顯示，胃癌和結(jié)直腸癌患者術(shù)后CTCs的檢測值與生存率具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，以檢測指標(biāo)≥2為分界，生存率明顯下降。與既往研究成果相符。因此，評估CTCs可能是預(yù)測胃癌結(jié)直腸癌患者腫瘤進展和預(yù)后的有用策略。本研究結(jié)果顯示，胃癌的高檢測CTC值較結(jié)直腸癌具有更差的預(yù)后，與臨床數(shù)據(jù)一致，提示我們更應(yīng)該重視胃癌患者的CTC值監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的趨勢，盡早更換治療策略。

在本研究收集的32例胃癌患者與36例結(jié)直腸癌患者中，CTC的數(shù)量(≥2)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度等無關(guān)，這與既往文獻中提示CTC與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率相關(guān)不符[19-21]，可能與樣本數(shù)量較少、CTC檢測中的誤差及隨訪時間短有關(guān)。

CTCs是一個有廣闊應(yīng)用前景的研究領(lǐng)域，但仍處于起步階段。由于在技術(shù)方法上缺乏共識，CTCs研究轉(zhuǎn)化為常規(guī)臨床檢驗還需要探索。CellSearch系統(tǒng)是美國FDA批準(zhǔn)的第一個檢測和列舉CTCs的標(biāo)準(zhǔn)半自動化方法。許多研究成功地使用CellSearch系統(tǒng)計數(shù)CTCs作為各種癌癥的預(yù)后和治療效果的指標(biāo)[22-23]。陰性富集聯(lián)合雙探針imFISH技術(shù)在腫瘤CTC檢測中具有較高的靈敏度和特異性，對于腫瘤的輔助診斷和早期檢測具有重要意義。由于本研究時間短、樣本量小，CTC 與療效等信息的相關(guān)性以及確定患者的陽性CTCs閾值尚有待于進一步的研究。