微衛(wèi)星不穩(wěn)定型胃癌及微衛(wèi)星穩(wěn)定型胃癌的免疫分型及預(yù)后分析

麻 婧，錢美睿，李建輝，李 瀟，韓渭麗，李增山，吳開(kāi)春，和水祥

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710061；2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化病醫(yī)院，腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710032；3. 空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院傳染科，陜西西安 710038；4. 空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，陜西西安 710032)

錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair, MMR)是細(xì)胞復(fù)制的主要修復(fù)機(jī)制之一，用以維持基因組的穩(wěn)定性。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示[1]，微衛(wèi)星不穩(wěn)定型(microsatellite instability, MSI)胃癌具有特征性的臨床及表觀遺傳學(xué)表現(xiàn)(MLH1沉默、高度突變、高度甲基化等)，可能與預(yù)后及免疫治療療效相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與微衛(wèi)星穩(wěn)定型胃癌(microsatellite stability, MSS)相比，在MSI腫瘤的局部微環(huán)境中可見(jiàn)明顯的免疫激活與抑制分子的表達(dá)，且與患者預(yù)后相關(guān)。針對(duì)微衛(wèi)星相關(guān)胃癌的檢測(cè)方法主要包括以下兩種：免疫組織化學(xué)染色(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)和PCR法檢測(cè)單核苷酸重復(fù)標(biāo)志物(NR-27、NR-21、BAT-26、BAT-25、NR-24、MONO-27)。

PD-1/PD-L1是目前腫瘤免疫的明星分子[2]，其單抗藥物在PD-L1陽(yáng)性的多種實(shí)體瘤治療中均能明顯延長(zhǎng)疾病無(wú)進(jìn)展生存期和總體生存期。本課題組聯(lián)合PD-L1表達(dá)和CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)，將胃癌分為4種類型，包括Ⅰ型(CD8+PD-L1+)、Ⅱ型(CD8-PD-L1-)、Ⅲ型(CD8-PD-L1+)、Ⅳ型(CD8+PD-L1-)，其中Ⅳ型胃癌預(yù)后最好[3]。此外，腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)與腫瘤的進(jìn)展及生存預(yù)后密切相關(guān)。本課題旨在研究MSI胃癌微環(huán)境中CD8、CD68、PD-1和PD-L1的表達(dá)情況及免疫分型占比，并分析其對(duì)預(yù)后的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例來(lái)源納入2012年3月至2012年8月于空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化病醫(yī)院行外科手術(shù)切除的60例原發(fā)胃癌患者，術(shù)前未進(jìn)行其他相關(guān)治療。術(shù)后從病理科調(diào)取石蠟組織，連續(xù)切片10張，厚度5 μm。病理分期根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control, UICC)第8版胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。患者的臨床病理資料由病歷系統(tǒng)收集獲得，預(yù)后信息通過(guò)電話隨訪獲得。本研究通過(guò)空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色及原位雜交石蠟切片行常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)染色，兔抗人單克隆抗體MLH1(ES05，DAKO)，MSH2(FE11，DAKO)，MSH6(EP49，DAKO)，PMS2(EP51，DAKO)，鼠抗人單克隆抗體CD68(KP1，DAKO)，CD8(C8/144B，CST)，兔抗人單克隆抗體PD-L1(SP142，Ventana)，羊抗人多克隆抗體PD-1(AF1086，R&D)。結(jié)腸上皮黏膜及間質(zhì)內(nèi)的淋巴細(xì)胞明確的核著色陽(yáng)性為陽(yáng)性對(duì)照，一抗稀釋液(CST)為空白對(duì)照。EB病毒檢測(cè)采用EBER原位雜交(中山金橋)，按說(shuō)明書(shū)操作，選取FISH確診的EBV陽(yáng)性淋巴瘤組織切片為陽(yáng)性對(duì)照組織。

1.3 染色結(jié)果判讀MMR蛋白在腫瘤細(xì)胞核明確著色表達(dá)判定為陽(yáng)性，任何比率腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性均視為陽(yáng)性；PD-L1染色陽(yáng)性細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞)比例大于1%視為陽(yáng)性；CD8染色陽(yáng)性細(xì)胞在間質(zhì)細(xì)胞中比例大于5%視為陽(yáng)性；PD-1染色陽(yáng)性細(xì)胞在間質(zhì)細(xì)胞中比例大于1%視為陽(yáng)性。

1.4 生存分析無(wú)病生存期定義為患者自接受手術(shù)日至出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或最后1次隨訪的時(shí)間，患者死亡或失訪以刪失值處理?？偵嫫诙x為患者自手術(shù)日至因任何原因死亡或最后1次隨訪的時(shí)間?？傮w隨訪時(shí)間為60個(gè)月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)，生存分析采用Log-rank秩檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本臨床病理學(xué)資料60例胃癌患者的腫瘤部位，浸潤(rùn)深度，分化程度，腫瘤性質(zhì)，AJCC分期，脈管/神經(jīng)侵犯，血清CEA、CA199、CA125水平，HER2表達(dá)及EBV感染狀態(tài)見(jiàn)表1。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2陽(yáng)性表達(dá)率分別為38.3%(23/60)、56.7%(34/60)、71.7%(43/60)和33.3%(20/60)。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2均為陽(yáng)性病例(MSS_1)為23.3%(14/60)，均為陰性(MSI)病例為25.0%(15/60)，任一分子為陽(yáng)性病例(MSS_2)為51.7%(31/60)。PMS2單獨(dú)缺失病例10.0%(6/60)，MSH2單獨(dú)缺失病例1.7%(1/60)，MLH1單獨(dú)缺失病例1.7%(1/60)。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、CD8、CD68、PD-1、PD-L1免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性組織及EBER原位雜交陽(yáng)性組織代表圖片見(jiàn)圖1。MSI胃癌血清CA199水平(179.19±166.52)高于MSS胃癌(51.85±20.91)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)。

表1 60例胃癌樣本的臨床病理學(xué)資料

Tab.1 Clinical pathological characteristics of the 60 gastric cancer samples [n(%)]

臨床病理特征MSIMSS_1MSS_2MSSP總數(shù)15143145腫瘤部位 賁門/胃底4(26.7)2(14.3)13(41.9)15(33.3) 胃體6(40.0)5(35.7)7(22.6)12(26.7) 下1/3胃4(26.7)7(50.0)11(35.5)18(40.0) 全胃1(6.7)0(0.0)0(0.0)0(0.0)0.224浸潤(rùn)深度 黏膜下層/黏膜肌層2(13.3)1(7.1)3(9.7)4(8.8) 黏膜肌層0(0.0)2(14.3)0(0.0)2(4.4) 固有肌層1(6.7)1(7.1)0(0.0)1(2.2) 肌層0(0.0)0(0.0)1(3.2)1(2.2) 漿膜/漿膜外12(80.0)10(71.4)27(87.1)37(82.2)0.755分化程度 低分化7(53.8)8(57.1)14(46.7)22(48.9) 中分化2(15.4)0(0.0)2(6.7)2(4.4) 高分化1(7.7)0(0.0)5(16.7)5(11.1) 低-中分化2(15.4)3(21.4)6(20.0)9(20.0) 中-高分化1(7.7)3(21.4)3(10.0)6(13.3)0.688腫瘤性質(zhì) 腺癌13(86.7)14(100.0)30(96.8)44(97.7) 黏液細(xì)胞癌1(6.7)0(0.0)0(0.0)0(0.0) 黏液腺癌1(6.7)0(0.0)0(0.0)0(0.0) 神經(jīng)內(nèi)分泌癌0(0.0)0(0.0)1(3.2)1(2.2)0.090T分期 T1a0(0.0)2(14.3)0(0.0)2(4.4) T1b2(13.3)1(7.1)2(6.5)3(6.6) T22(13.3)1(7.1)1(3.2)2(4.4) T34(26.7)4(28.6)16(51.6)20(44.4) T4a7(46.7)5(35.7)11(35.5)16(35.6) T4b0(0.0)1(7.1)1(3.2)2(4.4)0.920N分期 N05(33.3)2(14.3)8(25.8)10(22.2) N12(13.3)4(28.6)7(22.6)11(24.4) N21(6.7)2(14.3)8(25.8)10(22.2) N3a3(20.0)4(28.6)6(19.4)10(22.2) N3b4(26.7)2(14.3)2(6.5)4(8.9)0.669M分期 M015(100.0)14(100.0)31(100.0)45(100.0) M10(0.0)0(0.0)0(0.0)0(0.0)AJCC分期 ⅠA2(13.3)2(14.3)2(6.5)4(8.9) ⅠB2(13.3)1(7.1)1(3.2)2(4.4) ⅡA0(0.0)1(7.1)2(6.5)3(6.7) ⅡB3(20.0)1(7.1)8(25.8)9(20.0) ⅢA1(6.7)3(21.4)10(32.3)13(28.9) ⅢB3(20.0)4(28.6)6(19.4)10(22.2) ⅢC4(26.7)2(14.3)2(6.5)4(8.9)0.709EBV感染狀態(tài)(+)0(0.0)1(7.1)3(10.0)4(8.9)0.564脈管浸潤(rùn)9(60.0)11(78.6)19(61.3)30(66.7)0.639神經(jīng)浸潤(rùn)11(73.3)11(78.6)27(87.1)38(84.4)0.442HER2表達(dá)(+)0(0.0)1(7.1)5(16.1)6(13.3)0.321CEA(x±s)12.78±7.245.84±2.3210.23±3.758.77±2.610.177CA199(x±s)179.19±166.5217.74±8.4168.32±30.4551.85±20.910.009CA125(x±s)14.72±1.8312.87±1.6311.92±1.1012.23±0.900.290

P值均為MSS與MSI比較獲得。

圖1 免疫組織化學(xué)染色及原位雜交

Fig.1 Immunohistochemistry (IHC) and in situ hybridization (ISH)

A～D：EBER原位雜交陽(yáng)性病例；E～F：MLH1染色陽(yáng)性；G～H：MSH2染色陽(yáng)性；I～J：MSH6染色陽(yáng)性；K～L：PMS2染色陽(yáng)性；M～N：CD8染色陽(yáng)性；O～P：CD68染色陽(yáng)性；Q～R：PD-L1染色陽(yáng)性；S～T：PD-1染色陽(yáng)性。A、C、E、G、I、K、M、O、Q和S的bar值為200 μm，×10；B、D、F、H、J、L、N、P、R和T的bar值為50 μm，×40。

2.2 CD8、CD68、PD-1、PD-L1在MSI及MSS胃癌中的表達(dá)CD8、CD68、PD-1、PD-L1陽(yáng)性染色結(jié)果見(jiàn)表2。CD8、PD-1及PD-L1在MSI和MSS病例中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.179、0.881、0.757)；CD68在MSS中的陽(yáng)性率明顯高于MSI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046)。

2.3 胃癌免疫分型在MSI/MSS中的占比MSI胃癌中免疫分型Ⅰ型(CD8+PD-L1+)、Ⅱ型(CD8-PD-L1-)、Ⅲ型(CD8-PD-L1+)及Ⅳ型(CD8+PD-L1-)的比例依次為20.00%、46.67%、20.00%及13.33%；MSS胃癌中上述比例依次為22.22%、33.33%、13.33%及31.11%(圖2)。

2.4 生存分析60例胃癌患者在60個(gè)月隨訪中未出現(xiàn)失訪病例。MSI胃癌患者在60個(gè)月隨訪中疾病復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移病例(5/15)及死亡病例(5/15)均未達(dá)到一半；MSS胃癌患者60個(gè)月隨訪中疾病復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移病例及死亡病例均為30例，疾病無(wú)進(jìn)展中位生存時(shí)間為25個(gè)月，總體中位生存時(shí)間為29個(gè)月。Log-rank生存分析顯示，MSI胃癌患者的疾病無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(P=0.036)及總體生存時(shí)間(P=0.041)均長(zhǎng)于MSS胃癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

表2 CD8、CD68、PD-L1及PD-1在MSI和MSS胃癌中的表達(dá)

Tab.2 The expressions of CD8, CD68, PD-L1 and PD-1 in MSI and MSS gastric cancer [n(%)]

分類CD8表達(dá)比例P值CD68表達(dá)比例P值PD-L1表達(dá)比例P值PD-1表達(dá)比例P值MSI5/15(33.3)6/15(40.0)6/15(40.0)8/15(53.3)MSS_112/14(85.7)14/14(100.0)7/14(50.0)10/14(71.4)MSS_212/31(38.7)17/31(54.8)9/31(29.0)13/31(41.9)MSS24/45 (53.3)0.17931/45 (68.9)0.04616/45 (35.5)0.75723/45 (46.7)0.881

MSS: MSS_1+MSS_2；P值均為MSS與MSI比較獲得。

圖2 MSI和MSS胃癌中各免疫分型占比

Fig.2 The percentage of immune types in MSI and MSS gastric cancer

3 討 論

2014年，TCGA[1]提出了一套全新的胃癌分子分型，包括EBV陽(yáng)性胃癌、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型(MSI)胃癌、基因組穩(wěn)定和染色體不穩(wěn)定型胃癌。其中，MSI胃癌具有高度突變、高度甲基化、MLH1沉默等特點(diǎn)。在結(jié)直腸癌及胃癌中，已經(jīng)證實(shí)組織化學(xué)染色預(yù)測(cè)MSI具有更高的敏感性和特異性[4]。在一小部分微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定的腫瘤中，除了MLH1和MLH2外還有其他基因可發(fā)生突變，如PMS2和MSH6[5]。我們用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)MLH1、MSH2、MSH6和PMS2水平，全面評(píng)估胃癌錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)分子的表達(dá)狀態(tài)。

圖3 MSI和MSS胃癌的疾病無(wú)進(jìn)展生存(disease-free survival)和總體生存(overall survival)分析

Fig.3 Disease-free survival and overall survival in MSI and MSS gastric cancer

微衛(wèi)星不穩(wěn)定主要集中在10%～15%結(jié)腸癌、Lynch綜合征和遺傳性非息肉性結(jié)腸癌中[6]。研究顯示，MSI胃癌主要為老年、女性、腸型多見(jiàn)，TNM分期較低且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目較少[7-8]。MSI狀態(tài)評(píng)估在胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)中有爭(zhēng)議[9-10]。我們研究發(fā)現(xiàn)，在疾病無(wú)進(jìn)展生存分析和總體生存分析中，MSI胃癌患者預(yù)后優(yōu)于MSS胃癌，可能與錯(cuò)配修復(fù)缺陷所產(chǎn)生的新抗原/腫瘤抗原有關(guān)。

MSI腫瘤微環(huán)境中淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)增多[11]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)在EBV陽(yáng)性胃癌微環(huán)境中淋巴細(xì)胞的比例升高。在本項(xiàng)研究中，5例EBV陽(yáng)性胃癌均存在一定程度的MMR分子表達(dá)缺失。根據(jù)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)和PD-L1表達(dá)水平進(jìn)行免疫分型，MSI胃癌主要以Ⅱ型為主，MSS胃癌主要以Ⅱ型、Ⅳ型為主。免疫分型的提出不僅對(duì)預(yù)后有很好的預(yù)測(cè)作用，還對(duì)未來(lái)的免疫治療有一定篩選作用。MSS腫瘤具有Ⅳ型免疫分型也許能夠在治療中獲得一定的疾病緩解。

巨噬細(xì)胞在腫瘤中的作用十分復(fù)雜，經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞有殺傷細(xì)菌及腫瘤細(xì)胞的作用；選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與微環(huán)境中PD-L1表達(dá)有關(guān)[12]。CD68是一個(gè)泛巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，且與預(yù)后密切相關(guān)[13]。在大部分腫瘤中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要表現(xiàn)出M2型作用，抑制免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞或者通過(guò)分泌細(xì)胞因子抑制具有殺傷作用的淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，MSS胃癌中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多，腫瘤免疫微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和抑制作用減弱，患者預(yù)后較差。

此外，PD-1/PD-L1在不同類型腫瘤及同一腫瘤不同亞型的表達(dá)程度有明顯差異[14]?？筆D-1/PD-L1藥物臨床試驗(yàn)結(jié)果提示，相比于MSS腫瘤，MSI腫瘤患者能夠獲得更好的臨床緩解，延長(zhǎng)生存時(shí)間[15-16]，可能與MSI腫瘤微環(huán)境中多種免疫分子的表達(dá)相關(guān)。MSI腫瘤因存在高度突變的潛質(zhì)，突變基因編碼翻譯的蛋白可以成為有潛力的腫瘤抗原而被免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除。隨著免疫的激活，抑制性分子的表達(dá)隨之升高，如PD-L1表達(dá)?？筆D-1/PD-L1治療可以打破這種平衡，更好地輔助免疫系統(tǒng)清除腫瘤細(xì)胞。因此，PD-L1的表達(dá)雖然反映了機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)，但也提示免疫系統(tǒng)的激活。我們研究發(fā)現(xiàn)，MSI和MSS胃癌中PD-L1表達(dá)水平無(wú)明顯差異，與課題組既往在胃癌中發(fā)現(xiàn)的PD-L1表達(dá)陽(yáng)性率基本一致。這可能提示，雖然MSS胃癌錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制完善，仍有其他多種因素(腫瘤細(xì)胞自身、腫瘤間質(zhì)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞分泌因子)誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)。

總之，本研究通過(guò)錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)分子MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的免疫組織化學(xué)染色篩選MSI和MSS胃癌，通過(guò)CD8、CD68、PD-1、PD-L1染色，發(fā)現(xiàn)CD68+巨噬細(xì)胞在MSS胃癌中的浸潤(rùn)程度明顯高于MSI胃癌。此外，MSI胃癌以Ⅱ型為主。以上研究結(jié)果對(duì)今后針對(duì)免疫相關(guān)分子設(shè)計(jì)單抗或靶點(diǎn)治療具有參考價(jià)值。