近紅外線、紫外線及二者共同作用對小鼠皮膚光老化的影響

劉鈺澤，劉 平，蘇 慧，楊榮麗

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710004；2. 十堰市太和醫(yī)院皮膚科，湖北十堰 442000；3. 西安一四一醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710089)

通過長期觀察受紫外線(ultraviolet, UV)輻射的皮膚，KLIGMAN于1986年提出光老化的概念。紫外線曾被認(rèn)為是光老化的主要原因，對紫外線的作用研究也一直是熱點。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)作為日光主體的紅外線(IR)，與紫外線有類似的作用，也可引起光老化。目前，紅外線引起光老化的主要機制仍未明確，有學(xué)者認(rèn)為紅外線中的近紅外線(IRA)及部分中紅外線(IRB)能達到組織的深層，引起熱休克反應(yīng)導(dǎo)致皮膚損傷，可激活細胞信號通路，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活細胞信號通路引起膠原降解，形成光老化[1]。膠原降解主要是細胞基質(zhì)中的基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPs)的作用結(jié)果，MMPs家族龐雜，目前已知的就有十幾種，其中MMP-1有著明顯的降解Ⅰ型和Ⅲ型膠原的作用[2]。有研究表明，在小鼠皮膚中MMP-1的作用被MMP-13替代[3]。因此，本實驗利用紫外線、近紅外線及二者聯(lián)合照射小鼠皮膚，通過HE染色、實時定量PCR、Western blot檢測小鼠皮膚中MMP-13的表達情況，觀察上述實驗條件對小鼠皮膚光老化的影響，從而為預(yù)防及治療光老化提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料紫外線燈箱、紅外線儀(重慶華倫弘歷實業(yè)有限公司)，臺式高速冷凍離心機(美國Beckmna公司)，MiniTrnas-Blot轉(zhuǎn)移電泳槽、PCR擴增儀、實時定量PCR儀(CFX96)、蛋白印跡設(shè)備、凝膠電泳儀、凝膠分析成像系統(tǒng)、EpS500/400電泳儀(均為美國Bio-Rad公司)。兔抗鼠MMP-13單克隆抗體(安博奧森生物技術(shù)有限公司)、兔抗鼠MMP-13單克隆一抗(Abcam公司)、One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit、PrimeScript RT Reagent Kit(日本TaKaRa公司)等。實驗動物選用雄性封閉群ICR小鼠(清潔級)50只，體質(zhì)量18～20 g，6～8周齡，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心(合格證：0014420)，清潔動物房，常規(guī)飼料和水喂養(yǎng)，溫度(23±2)℃，濕度(54±4)%，12 h晝夜交替。

1.2 方法

1.2.1動物分組 小鼠隨機分為5組：空白組、IRA組、UV組、IRA/UV組、UV/IRA組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進行光照干預(yù)，干預(yù)前去除小鼠背部毛發(fā)。

1.2.2干預(yù)方法 第1、2、4、5、7天為照射日，第3、6天為休息日，照射日的晚8點進行照射。自制UV燈箱照射：燈箱預(yù)熱15 min，并測量光強度。小鼠置于燈箱正中，光源距小鼠背部30 cm照射；5次/周，第1周為1 h，后每周遞增20 min，第4周照射時間120 min保持至第14周。UV燈箱組成：40 W UVA燈管2支，光源波長315～400 nm，峰值365 nm；40 W UVB燈管4支，光源波長280～315 nm，峰值312 nm；累計照射劑量UVA 310.4 J/cm2，UVB 46.6 J/cm2。IRA照射：儀器預(yù)熱10 min，并測量光強度，小鼠置于光源正中，紅外線照射儀距離小鼠背部40 cm，5次/周，30 min/次，持續(xù)至第14周。紅外線儀波長0.78～2.8 μm，功率100 W，IRA累計照射劑量：1.26×107J/cm2。 IRA/UV組即在IRA照射完立即進行UV照射，而UV/IRA組則正好相反。取材：15周的第1天，即最后1次照射24 h后取材。脫毛劑去除小鼠背部毛發(fā)，次日麻醉后取頸背部皮膚約3 cm×2 cm，部分固定3 d，行HE染色；另取2～3 g，-80 ℃冰箱保存，實時定量PCR和Western blot使用。

1.2.3HE染色 固定取材的皮膚組織，包埋、切片，常規(guī)HE染色，觀察染色結(jié)果。

1.2.4免疫組化 組織固定、脫蠟、復(fù)水、過氧化氫酶滅活、細胞打孔，熱修復(fù)；封閉，滴加一抗(兔抗鼠MMP-13)，二抗；顯色，復(fù)染，鏡驗；觀察并計算結(jié)果。

1.2.5實時定量PCR 取凍存組織，剪碎，加液氮研磨成粉末狀，按照One Step Prime Script miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒提取總RNA。提取的總RNA經(jīng)紫外線分光光度計測定濃度后，按照PrimeScript RT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，進行反轉(zhuǎn)錄實驗；反應(yīng)結(jié)束后，將獲得的cDNA用于PCR或放在-20 ℃保存。RT-PCR設(shè)計、合成MMP-13引物序列，上游5′-CATCCATCCCGTGACCTTAT-3′，下游5′-GCATGACTCTCACAATGCGA-3′；內(nèi)參GAPDH上游5′-CCCACTAACATCAAATGGGG-3′，下游5′-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3′。qPCR反應(yīng)條件95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，共39個循環(huán)；重復(fù)3次反應(yīng)，取平均Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，用Ct值計算相對表達含量。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達 將組織研磨至粉狀；加入裂解液，裂解40 min后，混合物離心4 ℃ 12 000 g，14 min，取上清，加6×loading buffer，100 ℃水中變性，上樣(樣品30 μL marker 5 μL)。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉過夜。兔抗鼠MMP-13一抗孵育，洗膜后加山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體二抗孵育；ECL顯影，獲取圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間計量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用Bonfferroni校正。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠皮膚變化空白組皮膚正常。IRA組較空白組皮膚紅，變薄，局部有輕微皺紋形成。UV組、IRA/UV組、UV/IRA組均見明顯的皺紋，皮膚松弛，粗糙，局部有紅斑結(jié)痂(圖1，表1)。

圖1 肉眼觀察小鼠皮膚情況

Fig.1 The skin changes in each group of mice observed with the naked eye

2.2 HE染色及免疫組化結(jié)果HE染色顯示(圖2)，空白組皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮規(guī)則，分界明顯，真皮層染色一致，膠原纖維束排列規(guī)整有序。IRA組真皮變薄，膠原纖維減少，排列結(jié)構(gòu)基本正常，真皮層血管增生明顯。UV組表皮不規(guī)則增生，真皮乳頭層萎縮，真皮層變薄，膠原纖維排列紊亂。 UV/IRA組和IRA/UV組表皮增厚和真皮變薄，真皮乳頭層消失，真皮結(jié)締組織膠原排列雜亂，部分糾結(jié)成團(表1)。MMP-13免疫組化染色顯示(圖3)，空白組的真皮、表皮都有少量的黃色顆粒。IRA組較空白組有更多的黃色顆粒，主要集中在真皮層。UV組、IRA/UV組和UV/IRA組的黃色顆粒較IRA組更多，表皮層有表達。圖3統(tǒng)計陽性細胞個數(shù)，計算MMP-13陽性細胞率，4組實驗組較空白組均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，表2)。

表1 小鼠皮膚老化表現(xiàn)(皺紋形成程度和組織病理觀察)

Tab.1 The skin photoaging of mice (skin wrinkles and histopathology) (n)

觀察指標(biāo)空白組IRAUVIRA/UVUV/IRA肉眼觀察皺紋形成程度(無/輕/中/重)10/0/0/02/8/0/00/1/2/70/0/2/80/0/2/8HE觀察真皮厚度(正常/變薄/增厚)10/0/04/6/00/10/00/10/00/10/0HE觀察膠原排列(正常/雜亂)10/010/00/100/100/10

圖2 小鼠皮膚的組織病理學(xué)改變Fig.2 The histopathologic changes of the mices skin (×10)

圖3 MMP-13免疫組化結(jié)果

Fig.3 MMP-13 in the mice’s skin detected by immunohistochemical method (×40)

表2 MMP-13蛋白在各組中的表達比較

Tab.2 The expression of MMP-13 in each group

組別總例數(shù)陽性數(shù)陽性率(%)P空白組771823.3—IRA組783038.4<0.05UV組1084844.4<0.05IRA/UV組904145.6<0.05UV/IRA組1125145.5<0.05

2.3 MMP-13蛋白和mRNA表達情況Western blot和實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，IRA組MMP-13蛋白與mRNA表達量較空白組增加(P<0.05)；UV組較IRA組表達上調(diào)(P<0.05)；IRA/UV組和UV/IRA組MMP-13蛋白與mRNA表達均較UV組增加(P<0.05)，并且IRA/UV組較UV/IRA組增加更明顯，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4、圖5)。

圖4 小鼠皮膚MMP-13蛋白的表達情況

Fig.4 The protein expression level of MMP-13 in the mice’s skin

與空白組(Ctr)比較，*P<0.05；與IRA組比較，#P<0.05；與UV組比較，△P<0.05；與IRA/UV組比較，▲P<0.05。

3 討 論

光老化皮膚的病理生理變化主要反映在：①細胞外基質(zhì)蛋白的降解增加；②膠原合成分泌減少和功能紊亂[4]。IRA引起成纖維細胞產(chǎn)生熱休克效應(yīng)，激活MAPKs通路，MMP-1、MMP-3、MMP-9表達增多[5]；SCHROEDER[6]發(fā)現(xiàn)，IRA促進成纖維細胞分泌MMP-1，與UV作用的通路不一樣，是一個反向調(diào)節(jié)的過程；KIM等[7]在人體試驗中也發(fā)現(xiàn)了IRA可引起Ⅰ型膠原的減少；諸多學(xué)者的研究均表明IRA可以作為獨立因素引起皮膚老化[8]，同時與UV一起有協(xié)同作用。

圖5 小鼠皮膚MMP-13 mRNA的表達情況

Fig.5 The mRNA expression level of MMP-13 in mice skin

與空白組(Ctr)比較，*P<0.05；與IRA組比較，#P<0.05；與UV組比較，△P<0.05；與IRA/UV組比較，▲P<0.05。

本實驗中，肉眼及HE染色結(jié)果均提示IRA組小鼠皮膚膠原降解、血管增生。長期反復(fù)暴露于IRA可造成血管增生和皮膚老化，IRA調(diào)節(jié)血管生成主要是其熱效應(yīng)上調(diào)VEGF和下調(diào)TSP-2引起[9]。UV組、UV/IRA組和IRA/UV組小鼠皮膚粗糙，彈性下降，形成明顯皺紋，HE結(jié)果示此3組有明顯的膠原纖維的減少，膠原糾結(jié)成團。BRAVERMAN等[10]發(fā)現(xiàn)光老化的皮膚膠原和彈力蛋白的減少，纖維排列雜亂，這與本研究結(jié)論一致。KIM等[7]在人體試驗中，發(fā)現(xiàn)反復(fù)暴露于紅外線下，可以引起前Ⅰ型膠原的表達減少，但是，LEE等[11]對無毛小鼠的試驗中，并沒有發(fā)現(xiàn)單獨的IR引起膠原纖維和彈力纖維的改變。這二者的不同結(jié)果可能是因為選用的IR波長不同及實驗對象不同。在FRANK等[12]的研究中發(fā)現(xiàn)，用UVB輻射經(jīng)IRA預(yù)照射后的人成纖維細胞，可以抑制凋亡通路的激活，與IRA作用于線粒體相關(guān)。SCHROEDER等[13]發(fā)現(xiàn)IR輻射人成纖維細胞后，會減少Ⅰ型膠原的合成和分泌。

本研究結(jié)果顯示，在IRA輻射后小鼠皮膚中MMP-13表達上調(diào)。SCHROEDER[14]發(fā)現(xiàn)，IRA可使人皮膚中MMP-1的表達上調(diào)，且MMP-1表達的主要位置在真皮而不是表皮；IR引起皮膚老化上調(diào)MMP-1的表達，干擾膠原的從頭合成。KIM等[7]也發(fā)現(xiàn)單次紅外線輻射人體皮膚會上調(diào)前膠原的表達，不會引起MMP-1的改變，但是長期重復(fù)暴露于紅外線時，會引起前膠原表達減少和MMP-1表達上調(diào)。鑒于小鼠皮膚中MMP-13作用與人皮膚中MMP-1的作用類似，以上結(jié)論與本實驗結(jié)果有相似性。

在本研究中，與UV組比較，IRA/UV組和UV/IRA組的MMP-13表達水平明顯上調(diào)。KIM[11]已經(jīng)證明，IRA具有放大UV引起的皺紋的作用。他們認(rèn)為紅外線促進MMP-13生成是IR的熱效應(yīng)，說明IRA上調(diào)MMP-13的表達，可能跟它的光效應(yīng)和熱效應(yīng)都有關(guān)。本次實驗聯(lián)合組上調(diào)MMP-13的原因可能是，聯(lián)合照射形成了疊加效果，所以MMP-13表達量較單一光源組上調(diào)。

兩種光源產(chǎn)生光老化的機制不盡相同。UV引起ROS產(chǎn)生途徑是：①直接激活細胞表面的受體，如EGF受體和細胞因子受體，促進細胞的代謝產(chǎn)生ROS[15]；②直接作用于細胞內(nèi)的生色基團，將電子傳遞給氧分子產(chǎn)生ROS[15]。IR引起ROS產(chǎn)生途徑則是：紅外線輻射的光子，被線粒體外膜的細胞色素氧化酶C吸收，改變線粒體膜上呼吸鏈組分活性，促進ROS生成。ROS激活ERK1/2和JNK通路，上調(diào)c-Jun和c-Fos的表達，促進AP-1的形成，AP-1進入細胞核相應(yīng)位點，促使MMPs表達增加[13]。

在本研究中，IRA/UV比UV/IRA組能更加明顯地升高MMP-13表達，說明UV的放大IRA光老化作用比IRA放大UV作用更加顯著。我們推測可能原因是：①IRA/UV組輻射后細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS含量高于UV/IRA組；②在預(yù)先接受UV照射后，IRA的相關(guān)傳導(dǎo)通路受損，無法產(chǎn)生ROS，從而激活下游通路，客觀上削弱了光老化作用。除了ROS影響，也有IR的熱效應(yīng)，紫外線和紅外線激活細胞因子等等改變MMP-13表達。另外TGF-β通路本身可以促進膠原形成，而近紅外線還有抑制TGF-β受體表達的作用，從不同途徑促進光老化[9]。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)近IR不但引起光老化，而且和UV相互影響，上調(diào)MMP-13表達，并加速小鼠皮膚光老化過程。我們實驗研究證明，在相同的照射條件下，兩種光源照射順序不同，引起小鼠皮膚表達MMP-13的量明顯不同。因此，防止近紅外線輻射，避免MMP-13形成，可能在預(yù)防小鼠皮膚光老化的皺紋形成中發(fā)揮重要作用。由于機體擁有一個完整而又復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制，關(guān)于ROS的含量、作用時間和具體所涉及的下游通路激活等等，未來有待進一步研究。