miR-384-5p通過阻斷BMP7轉(zhuǎn)錄后調(diào)控促進腎纖維化

張文靜，孫吉平，呂 佳，李 燕，耿瀛洲，邵耀中，尹愛萍，路萬虹

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，陜西西安 710061)

腎臟纖維化是所有慢性腎臟疾病發(fā)展的最終結(jié)果，是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因之一。無論是各種原發(fā)性腎小球疾病，還是糖尿病腎病、梗阻性腎病等，腎功能損害都與腎臟纖維化病變程度密切相關(guān)[1]。如何防治腎臟纖維化已成為當(dāng)今腎病研究中的一個重要課題。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)-7是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGFβ)超家族的一員，并在腎臟中高表達，在小鼠體內(nèi)BMP7基因缺失會導(dǎo)致腎發(fā)育損傷[2]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BMP7在腎小管上皮細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的調(diào)控中，通過e-鈣黏連蛋白(一種關(guān)鍵的上皮細胞粘附分子)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)[3]。系統(tǒng)性應(yīng)用重組BMP7可減輕腎小管上皮細胞的損害程度，并能減輕慢性腎損傷。最近研究發(fā)現(xiàn)EMT的調(diào)控中存在BMP7和TGFβ1信號通路的交叉作用[4-5]。但是，迄今為止有關(guān)BMP7在腎損傷中的分子調(diào)控機制仍未明確。

microRNAs(miRNAs)在生理和病理條件下(包括腎損傷)可調(diào)控多種蛋白的表達[6-7]。miRNAs是含有18～23個核苷酸的非編碼小RNA，通過與靶基因mRNA的3′-未翻譯區(qū)(3′-UTR)堿基配對來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平[8-9]。miR-384-5p是miRNA家族的成員，已發(fā)現(xiàn)其通過PIK3CD在心臟保護中發(fā)揮重要作用，調(diào)控淀粉樣前體蛋白及阿爾茨海默病相關(guān)的β-分泌酶的表達[10-12]。不過，到目前為止，miR-384-5p并沒有被定義為BMP7靶向miRNA，而且它在腎損傷、腎纖維化和腎衰竭方面的作用尚不清楚。因此，本研究建立了小鼠單側(cè)輸尿管阻塞(unilateral ureteral obstructive, UUO)模型，通過miR-384-5p研究BMP7在腎小管上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的分子調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑選用12周的C57/6雄性小鼠(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供)。脂質(zhì)體2000(Invirogen)，RIPA裂解液(Sigma)，兔BMP7和抗α-tubulin(Cell Signaling,San Jose, CA, USA)，HRP標(biāo)記的抗兔抗體(Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA, USA)，miRNeasy試劑盒(Qiagen, Hilden, Germany)，高容量逆轉(zhuǎn)錄DNA試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)，PCR試劑盒(Qiagen)，位點突變的BMP7 3′-UTR(Creative BiogeneShirley, NY, USA)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega)。

1.2 UUO模型的制作用6號絲線將12周C57/6雄性小鼠進行左側(cè)輸尿管結(jié)扎[13]，為UUO組，共20只；另設(shè)假手術(shù)組20只(未結(jié)扎)。術(shù)后3 d，每組處死10只小鼠分離出腎小管上皮細胞；術(shù)后14 d，每組再處死另外10只小鼠，觀察腎組織纖維化程度及BMP7 mRNA和蛋白質(zhì)表達情況。

1.3 腎臟纖維化的免疫組化及定量研究取UUO組和假手術(shù)組小鼠(正常對照)腎臟，常規(guī)制成5 μm厚石蠟切片，進行Masson染色。每張切片隨機選擇20個區(qū)域。陽性染色面積(藍色)與整個區(qū)域的比值為腎臟纖維化程度。并檢測BMP7 mRNA和蛋白質(zhì)表達情況。

1.4 細胞分離、培養(yǎng)及處理按照已報道方法[14]將小鼠腎臟用流式細胞術(shù)熒光激活細胞分選(FACS)分離成單個細胞。分離腎包膜后切成2 mm的碎塊，放入0.5 g/L膠原酶，270 r/min，37 ℃水浴搖床30 min；隨后用40 nm的過濾器收集單個細胞，熒光素標(biāo)記的抗E黏連蛋白孵育，通過流式細胞術(shù)分類熒光標(biāo)記腎小管上皮細胞，用于后續(xù)的實時定量PCR或Western blot檢測，或進行細胞培養(yǎng)(RPMI 1640培養(yǎng)基+100 mL/L胎牛血清+100 μg/mL青霉素+250 ng/mL的鏈霉素)。

1.5 miRNA靶點預(yù)測和3′-UTR熒光素酶活性分析由于miRNA是蛋白質(zhì)最重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，對BMP7靶向miRNA進行生物信息學(xué)分析。篩選了滿足下面兩個條件的所有候選基因：靶向BMP7 mRNA；在腎臟中表達。用targetscan算法預(yù)測靶向BMP7的候選miRNA靶點，利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建熒光素酶報告基因。BMP7 3′-UTR靶序列以及在miR-384-5p結(jié)合位點存在突變的BMP7 3′-UTR(BMP7 3′-UTR mut)均購自Creative Biogene(Shirley, NY, USA)。

純化的腎小管上皮細胞接種于24孔板培養(yǎng)24 h，之后共轉(zhuǎn)染1 μg熒光素酶報告質(zhì)粒和miR-384-5p-修飾的質(zhì)粒。應(yīng)用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將表達miR-384-5p的質(zhì)粒、表達反義miR-384-5p的質(zhì)粒以及對照質(zhì)粒分別通過脂質(zhì)體2000(Invirogen)對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)染(即miR-384-5p組、反義組、對照組)。培養(yǎng)腎小管上皮細胞消化分散、離心(1 000 r/min 5 min)后，用培養(yǎng)液重懸并計數(shù)后，每個35 mm培養(yǎng)皿加入0.8×106細胞，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天進行轉(zhuǎn)染。按脂質(zhì)體體積(μL)∶DNA質(zhì)量(μg)1∶2制備轉(zhuǎn)染試劑。含有無血清培養(yǎng)基的試管中加入轉(zhuǎn)染試劑后震蕩，室溫放置10～15 min；吸棄培養(yǎng)基并用PBS清洗細胞1次；加入含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。再次進行細胞傳代，按0.8×105個細胞/35 mm培養(yǎng)皿將細胞重新分入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)研究。

制作UUO模型時通過靜脈注射空質(zhì)粒(n=10)或反義-miR-384-5p質(zhì)粒(n=10)，14周后處死小鼠，腎組織切片進行Masson染色來評估腎纖維化程度。

1.7 Western blot檢測用添加蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液分別提取轉(zhuǎn)染miR-384-5p組、反義組、對照組的細胞總蛋白，吹打混勻，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清，BCA法測定總蛋白濃度，充分變性后加上樣緩沖液，于SDS-PAGE變性凝膠進行電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，50 mL/L脫脂牛奶室溫封閉1.5 h。分別用兔BMP7和抗α-tubulin 4 ℃孵育過夜(1∶100)，HRP標(biāo)記的抗兔抗體(1∶100)孵育2 h。用ECL發(fā)光液在暗室進行壓片、顯影、曝光。

1.8 實時定量PCR檢測使用miRNeasy 試劑盒提取總RNA，取2 μg RNA用高容量逆轉(zhuǎn)錄DNA試劑盒制備cDNA，用PCR試劑盒進行聚合酶鏈反應(yīng)。所有引物購自Qiagen?；蛳鄬Ρ磉_水平由內(nèi)參α-tubulin和實驗對照確定。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用GraphPad Prism 6進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較用單因素方差分析法，用LSD-t檢驗進行兩組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 UUO模型中BMP7 mRNA和蛋白的表達情況UUO組第14天腎纖維化顯著增加(t=2.026，P<0.05)；腎組織的BMP7 mRNA表達顯著增加(t=3.342，P<0.05)，但BMP蛋白表達沒有增加(t=0.727、P>0.05，圖1)。這提示UUO腎臟中可能存在BMP7的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程。

圖1 UUO模型制作及纖維化情況和BMP7 mRNA和蛋白的表達變化

Fig.1 UUO model established, renal fibrosis, and mRNA and protein expressions of BMP7

A：實驗設(shè)計流程示意圖；B：Masson染色顯示小鼠腎纖維化程度(×200)；C：Masson染色定量結(jié)果(n=10，與Sham組比較，*P<0.05)；D：RT-qPCR檢測結(jié)果(n=10，與Sham組比較，*P<0.05)；E：Western blot檢測結(jié)果(n=10，與Sham組比較，NS：P>0.05)。

2.2 腎小管上皮細胞中miR-384-5p通過與BMP7 mRNA的3′-UTR直接結(jié)合進而抑制BMP7蛋白翻譯targetscan算法預(yù)測靶向BMP7的候選miRNA包括：miR-384-5p、miR-30、miR-92和miR-128。然而，對BMP7靶向miRNA的雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，在UUO模型制作前后miR-30、miR-92和miR-128的水平都非常低，表明其對BMP7的作用可能有限；而miR-384-5p水平最高，并且在UUO后的水平進一步升高(圖2A)。生物信息學(xué)分析顯示，miR-384-5p在BMP7 mRNA的3′-UTR處具有結(jié)合位點，位于第584位至第590位堿基位點處(圖2B)。

在UUO后3 d通過FACS分選腎小管上皮細胞(圖2C)。隨后轉(zhuǎn)染攜帶miR-384-5p的質(zhì)?；蛟贑MV啟動子控制下的反義miR-384-5p(as-miR-384-5p)，在純化的腎小管上皮細胞中過表達miR-384-5p或者抑制miR-384-5p。通過RT-qPCR證實腎小管上皮細胞中miR-384-5p水平的改變(t=2.123，P<0.05，圖2D)。結(jié)果表明，在腎小管上皮細胞中miR-384-5p通過與BMP7 mRNA的3′-UTR直接結(jié)合而抑制BMP7蛋白翻譯。

圖2 miR-384-5p結(jié)合BMP7 mRNA的3′-UTR抑制BMP7蛋白翻譯

Fig.2 miR-384-5p binding to the 3′-UTR of BMP7 mRNA inhibited its translation into renal tubular epithelial cells

A：在UUO前后腎組織中BMP7靶向miRNA的水平；B：對BMP7 mRNA的野生型(wt)及突變體(mut)3′-UTR上的miR-384-5p結(jié)合位點的生物信息學(xué)分析；C：在UUO后3 d，基于E-cadherin(E-cad)的表達通過FACS對腎小管上皮細胞進行分選；D：用miR-384-5p質(zhì)粒、反義miR-384-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞，n=10,*P<0.05；E：腎小管上皮細胞中共轉(zhuǎn)染1 μg 反義miR-384-5p(as-miR-384-5p)質(zhì)粒和1 μg野生型 BMP7 3′-UTR或突變質(zhì)粒，n=10,*P<0.05；F：腎小管上皮細胞中共轉(zhuǎn)染1 μg miR-384-5p(miR-384-5p)質(zhì)粒和1 μg野生型 BMP7 3′-UTR或突變質(zhì)粒，n=10,*P<0.05。

2.3 腎小管上皮細胞中miR-384-5p對BMP7表達的影響檢測發(fā)現(xiàn)miR-384-5p修飾并沒有改變腎小管上皮細胞中BMP7 mRNA水平(t=-0.223，P>0.05，圖3A)；miR-384-5p修飾的腎小管上皮細胞中BMP7蛋白顯著減少，而as-miR-384-5p修飾的腎小管上皮細胞中BMP7蛋白顯著增加(t=2.134，P<0.05，圖3B)。提示腎小管上皮細胞中miR-384-5p確實能抑制BMP7蛋白翻譯。

2.4 抑制miR-384-5p能減輕UUO誘導(dǎo)的腎臟損傷本研究結(jié)果顯示，14 d時UUO組存在較強的纖維化，而在as-miR-384-5p組腎臟纖維化程度明顯減弱(t=2.354，P<0.05，圖4A～C)。盡管as-miR-384-5p處理組BMP7 mRNA沒有改變(t=0.435，P>0.05)，但在as-miR-384-5p處理組小鼠的腎臟中BMP7蛋白顯著增加(t=1.986，P<0.05，圖4D、E)。這些結(jié)果提示抑制miR-384-5p能減輕UUO誘導(dǎo)的腎損傷。

3 討 論

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是一個重要的生物學(xué)現(xiàn)象，在胚胎發(fā)育、腫瘤進展以及器官纖維化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。雖然許多信號通路在EMT進程中具有協(xié)同作用，但是TGFβ1仍被認為是腎小管上皮細胞EMT的主要誘因[15-16]。在腎小管上皮細胞中，BMP7治療能逆轉(zhuǎn)TGFβ1誘導(dǎo)的EMT，與內(nèi)源性E-鈣黏連蛋白再表達和上皮細胞表型的恢復(fù)有關(guān)[3]。已有報道，在多種疾病狀態(tài)下，BMP7和TGFβ1之間存在拮抗作用[17-18]。在腎損傷后BMP7也是拮抗TGFβ1誘導(dǎo)的促纖維化作用的關(guān)鍵因子。然而，BMP7在腎損傷中的分子調(diào)控機制仍未確定。

圖3 miR-384-5p-修飾對腎小管上皮細胞中BMP7表達的影響

Fig.3 miR-384-5p-modification changed the level of BMP7 protein in renal tubular epithelial cells

A：RT-qPCR檢測結(jié)果；B：Western blot檢測結(jié)果。n=10,*P<0.05。

本研究發(fā)現(xiàn)UUO模型中，BMP7蛋白水平并沒有隨著mRNA的表達增加而升高，提示BMP7轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能會減弱其對抗TGFβ1的效應(yīng)。

抑制這種作用是否可以增加BMP7蛋白水平來拮抗TGFβ1的作用？由于miRNAs在蛋白質(zhì)翻譯過程中起著重要的作用，本研究使用生物信息學(xué)分析進行序列匹配，靶向BMP7候選miRNAs包括miR-384-5p、miR-30、miR-92以及miR-128。然而除了miR-84-5p外，在UUO前后，其余miRNA的水平非常低，這表明它們對BMP7的影響可能是有限的。另一方面，不僅在腎臟中可以檢測到miR-384-5p水平，并且體外實驗中也顯示miR-384-5p靶向抑制BMP7。由于本研究使用的是原代腎小管上皮細胞，所以這些結(jié)果不會由細胞的特定功能導(dǎo)致。

圖4 抑制miR-384-5p減輕UUO誘導(dǎo)的腎臟損傷

Fig.4 Inhibition of miR-384-5p alleviated UUO-induced renal injury

A：實驗流程圖；B、C：各組腎組織Masson染色圖像和定量結(jié)果(×200)；D：RT-qPCR結(jié)果；E：Western blot結(jié)果。n=10,*P<0.05；NS：P>0.05。

BMP7 mRNA表達增加通過拮抗腎損傷后炎癥巨噬細胞和成纖維細胞的TGFβ1表達增多而實現(xiàn)其可能的保護機制。然而，miR-384-5p的存在抑制了BMP7蛋白的平行增加。因此，本研究抑制miR-384-5p的作用，通過使用反義miRNA阻斷BMP7的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而增加BMP7蛋白的水平并在腎纖維化發(fā)展中發(fā)揮腎臟保護作用。

綜上所述，miR-384-5p通過與BMP7 mRNA的3′-UTR的直接結(jié)合抑制BMP7蛋白翻譯，從而減弱BMP7蛋白對腎臟損傷的保護作用。miR-384-5p作為調(diào)節(jié)腎損傷后纖維化相關(guān)發(fā)病機制的關(guān)鍵因子，有希望成為預(yù)防腎纖維化的創(chuàng)新性治療靶點。