長鏈非編碼RNA-TDRG1高表達對宮頸癌臨床進展及預后不良的影響

范 陽，李 潔，張忠明，劉明暉，單玉珍，張逢香，鄒余糧

(1. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院婦產科，陜西西安 710061；2. 西安航天總醫(yī)院婦科，陜西西安 710010)

宮頸癌是全球范圍內最常見的婦科癌癥之一，約占女性癌癥死亡患者人數(shù)的10%～15%[1]。宮頸癌早期治療效果較好，中晚期則預后較差[2]，但早期多無明顯臨床癥狀，巴氏篩查雖有助于早發(fā)現(xiàn)、早治療，但仍有相對較高的假陰性率[3]。同時，宮頸癌現(xiàn)階段尚缺乏高效特異的腫瘤標志物，為早期診斷及隨訪觀察均帶來不便[4]。因此，目前亟需開發(fā)新的用于宮頸癌早期診斷、治療以及預后判斷的臨床生物標志物。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是一類長度超過200 bp的轉錄本[5]，曾被認為是基因轉錄的“噪音”，是特定基因轉錄Pol Ⅱ的副產物。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs可以編碼基因的上游啟動子區(qū)域，干擾下游基因的表達；結合蛋白編碼基因轉錄形成互補的雙鏈DNA復合體，干擾mRNA的切割或導致選擇性剪接；與特定蛋白結合以調節(jié)其活性；或作為小RNA的前體分子，如microRNAs (miRNA)或piwi-interacting RNAs (piRNAs)[6]，在細胞周期、細胞分化等生理功能中發(fā)揮重要作用[7]。

近年來，有學者證實lncRNAs在多種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，如宮頸癌等[8-9]。新發(fā)現(xiàn)的人類睪丸特異性基因睪丸發(fā)育相關基因1 (human testis development-related gene 1, TDRG1)編碼了100個氨基酸蛋白，這些蛋白不具有任何已知的蛋白結構域[10]。TDRG1可能通過調節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路參與睪丸生殖細胞腫瘤的發(fā)生[11]。研究表明，存在lncRNA-TDRG1通過成纖維細胞生長因子1(FGF1)相關機制促進骨髓間充質干細胞增殖[12]。而且，lncRNA-TDRG1可能參與上皮性卵巢癌的發(fā)生和進展[13]，并通過結合和靶向VEGF-A蛋白增強子宮內膜癌的致瘤性[10]。然而，lncRNA-TDRG1在宮頸癌中的作用目前尚未被研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料組織樣本來源于西安交通大學第一附屬醫(yī)院婦科、西安航天總醫(yī)院婦科宮頸病變患者，宮頸癌組織及鄰近正常宮頸組織(距離宮頸癌組織>5 cm且經病理檢查證實為正常組織)各取60例。所有組織樣本均在手術過程中獲取，立即放入液氮速凍，并轉入-130 ℃冰箱儲存直至RNA提取時取出。組織病理診斷由2名病理學家完成?；颊咝g后總體生存期為手術后至宮頸癌相關疾病死亡時間。本實驗已通過西安交通大學第一附屬醫(yī)院及西安航天總醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者已簽署知情同意書，組織樣本均采取匿名形式收集和使用?；颊呒{入標準：①術前未經過放療、化學藥物治療和靶向性治療；②接受手術治療；③病理確診為宮頸癌患者；④患者按照美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)TNM分期和國際婦產科聯(lián)盟(FIGO)宮頸癌手術分期系統(tǒng)；⑤有完整的流行病學資料、相關臨床信息及個人隨訪資料。

1.2 細胞株宮頸癌細胞株：SiHa(目錄號：TCHu113)，HeLa(目錄號：TCHu187)，C-33A(目錄號：TCHu176)，CaSki(目錄號：TCHu137)購自上海中國科學院細胞庫；正常宮頸細胞株Ect1/E6E7(編號：BNCC339959)購自北京北納生物細胞庫。

1.3 主要試劑RNA提取試劑盒：GenEluteTMTotal RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich, Germany)；反轉錄試劑盒：Prime Script RT Reagent Kit(TaKaRa, Ohtsu, Shiga, Japan)；熒光定量試劑盒：SYBR Premix ExTaqTMⅡ Kit (TaKaRa, Ohtsu, Shiga, Japan)；TDRG1及管家基因GAPDH引物由上海生工生物公司合成。lncRNA-TDRG1引物序列F：5′-TCTTCCCTGGCTTGGC-3′；R：5′-TGGGCTCTTTCGTGGC-3′；GAPDH引物序列F：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′；R：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.4 RNA提取和實時定量PCR按照RNA提取試劑盒GenEluteTMTotal RNA Purification Kit使用說明提取各組織及體外培養(yǎng)細胞株中的總RNA，并進行質量控制。將總RNA(1 μg)按照Prime Script RT Reagent Kit說明書反轉錄成cDNA，反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。將獲得的反轉錄產物，按照SYBR Premix ExTaqTMⅡ Kit說明書，確定反應體系和反應條件，擴增過程由iQ5 instrument(Bio-Rad)完成，使用FastStart Essential DNA Green Master (Roche)去檢測lncRNA-TDRG1表達，qRT-PCR反應條件：95 ℃變性10 s；60 ℃退火15 s；72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。所有樣品均設復孔，實驗重復3次。采用2-ΔΔCt或ΔCt (CtlncRNA-TDRG1-CtGAPDH)的方法來計算和標準化lncRNA-TDRG1的相對表達量。

2 結 果

2.1 宮頸癌組織和癌細胞株中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達水平qRT-PCR檢測60對宮頸癌和鄰近正常組織中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達，結果顯示：兩組組織中l(wèi)ncRNA-TDRG1表達均呈正態(tài)分布(P=0.272，P=0.180)，且方差齊(P=0.472)，具有可比性。和鄰近正常組織相比，lncRNA-TDRG1在宮頸癌組織中的表達顯著增加(P<0.001，圖1A、B)。qRT-PCR檢測4種不同類型的宮頸癌細胞系，以及正常宮頸細胞系Ect1/E6E7中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達。結果顯示，lncRNA-TDRG1在宮頸癌細胞株中的表達顯著高于正常宮頸細胞系Ect1/E6E7(P<0.05，圖1C)。

圖1 宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達變化

Fig.1 The expression of lncRNA-TDRG1 in cervical cancer tissues

A：同一患者宮頸癌組織(cancer tissue)以及鄰近正常組織(adjacent normal tissue)中l(wèi)ncRNA-TDRG1的相對表達量(n=60)，ΔCt值低提示lncRNA-TDRG1高表達；B：qRT-PCR檢測提示，和鄰近正常組織比較，宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA-TDRG1呈高表達(**P<0.001)；C：不同類型的4種宮頸癌細胞系中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達量高于正常宮頸細胞系Ect1/E6E7(*P<0.05)。

2.2 宮頸癌患者lncRNA-TDRG1表達水平和臨床病理參數(shù)的關系按照宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達水平，我們取中位表達量截斷，分為低表達組(n=30)和高表達組(n=30)。lncRNA-TDRG1表達水平與宮頸癌臨床病理參數(shù)的相關性如表1所示，結果說明宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達水平和癌細胞的分化程度(高中分化vs低分化，P=0.019)，以及淋巴結轉移(有vs.無，P=0.037)密切相關，但是和年齡(P=0.795)，以及FIGO分期(P=0.589)無相關性。以上結果提示，高表達lncRNA-TDRG1可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關。

2.3 lncRNA-TDRG1高表達是宮頸癌患者預后不良的因素Kaplan-Meier和Log-rank檢驗結果表明，lncRNA-TDRG1的表達與宮頸癌患者的總體生存率直接相關，即宮頸癌患者高表達lncRNA-TDRG1時，總體預后更差(P=0.041，C-index=0.89，圖2)。多因素分析顯示，lncRNA-TDRG1高表達是宮頸癌患者預后不良的危險因素(P=0.006，表2)，提示lncRNA-TDRG1高表達患者的總體預后更差。

表1 宮頸癌患者lncRNA-TDRG1表達水平和臨床病理參數(shù)的關系

Tab.1 Relationship between lncRNA-TDRG1 expression and clinicopathological characteristics in cervical cancer patients

CharacteristicsNumberlncRNA-TDRG1 expressionHigh(n=30)Low(n=30)PAge(year)0.795 ≤45341816 >45261214FIGO stage0.589 Ⅰ21912 Ⅱ392118Cell differentiation0.019 Moderate and well321121 Poor28199Lymph node metastasis0.037 Yes332112 No27918

圖2 lncRNA-TDRG1表達和宮頸癌患者總體生存率之間的關系(log-rank test,P<0.05)

Fig.2 The relationship between lncRNA-TDRG1 expression and overall survival of cervical cancer patients

3 討 論

宮頸癌是一種復雜的疾病，涉及多種因素，雖然其發(fā)病原因為宮頸高危型HPV病毒持續(xù)感染，但具體病理機制仍未完全明確[14]。盡管目前宮頸癌疫苗(HPV疫苗)正逐步得到推廣[15]，但對于宮頸癌患者而言，能夠早期診斷和治療仍是獲得良好預后的關鍵。因此，開發(fā)新的用于宮頸癌早期診斷、治療以及預后判斷的臨床生物標志物非常重要。

隨著基因測序技術的發(fā)展，學界普遍認為低于2%的人類基因用來編碼蛋白質，剩下98%的基因則編碼noncoding RNAs(ncRNAs)，包括lncRNAs和circRNAs[16]。近年來，研究表明lncRNAs在多種類型疾病，尤其腫瘤性疾病中起重要作用[8]，宮頸癌中也有許多l(xiāng)ncRNAs的異常表達[17]。如研究者發(fā)現(xiàn)，lncRNA-HOTAIR在宮頸癌組織中上調，并且和FIGO分期、淋巴轉移、腫瘤大小以及腫瘤浸潤深度有關，lncRNA-HOTAIR使腫瘤對放療不敏感，促進腫瘤細胞遷移和侵襲[18-19]。lncRNA-799也在宮頸癌中高表達，并作為miR-454-3P的ceRNA上調TBL1XR1表達，促進腫瘤轉移[20]。同時，lncRNA-MEG3被發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中下調，功能研究發(fā)現(xiàn)其可引起癌細胞G2/M周期阻滯和細胞凋亡[21]，并且這種作用可能和其作為分子海綿調控miR-21-5p有關[22]。宮頸癌中l(wèi)ncRNA-TUSC8也呈下調趨勢，其可通過減少c-Myc表達抑制癌細胞增殖[23]。綜上所述，lncRNAs在宮頸癌中呈現(xiàn)出表達和功能的多樣性，參與了宮頸癌的進展和預后。

表2 單變量和多變量Cox回歸分析60例宮頸癌患者的總生存期

Tab.2 Univariate and multivariate Cox regression analyses of overall survival in 60 cervical cancer patients

VariableUnivariate analysis (Cox: enter)HR95% CIPMultivariate analysis (Cox: forward conditional)HR95% CIPAge (year) ≤45 vs.>451.0130.761-1.4840.957FIGO staging Ⅰ vs. Ⅱ1.2170.869-1.7310.259Cell differentiation Poor vs. moderate and well1.9351.377-2.813<0.0011.9871.390-2.859<0.001Lymph node metastasis Yes vs. no2.4691.696-3.574<0.0012.1371.471-3.112<0.001lncRNA-TDRG1 High vs. low1.9601.287-2.691<0.0011.7631.256-2.417 0.006

HR：風險比； 95%CI：95%置信區(qū)間。

lncRNA-TDRG1是最近新發(fā)現(xiàn)的一種TDRG1基因相關的非編碼RNA[10]。研究發(fā)現(xiàn)，存在lncRNA-TDRG1通過成纖維細胞生長因子1(FGF1)相關機制促進骨髓間充質干細胞增殖[12]。有學者還證實，早期胃癌患者癌組織和血漿中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達水平呈正相關，并且lncRNA-TDRG1和早期胃癌的淋巴結轉移相關，可能是早期胃癌潛在的診斷生物標志物[24]。而且，lncRNA-TDRG1可能參與上皮性卵巢癌的發(fā)生和進展[13]，并通過結合和靶向VEGF-A蛋白增強子宮內膜癌的致瘤性[10]。然而，目前l(fā)ncRNA-TDRG1在宮頸癌中的表達和功能未知。

本研究首次證實宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA-TDRG1的表達呈顯著上調趨勢，并且在不同的宮頸癌細胞株中得到證實。這一結果提示，lncRNA-TDRG1可能在宮頸癌中發(fā)揮原癌基因的功能。同時，進一步分析lncRNA-TDRG1表達和宮頸癌臨床病理參數(shù)的關系時發(fā)現(xiàn)，lncRNA-TDRG1高表達和癌細胞分化程度，以及淋巴結轉移情況呈顯著正相關，我們推測下調lncRNA-TDRG1的表達可能抑制腫瘤的侵襲和遷移。生存分析顯示，宮頸癌患者高表達lncRNA-TDRG1時，腫瘤惡性程度更高，患者生存時間更短，總體預后更差。根據多因素分析，lncRNA-TDRG1檢測可作為一種新的生物標志物，補充傳統(tǒng)的生物標志物，預測宮頸癌患者的預后并改善臨床結局。

總之，本研究表明lncRNA-TDRG1在宮頸癌中普遍表達升高，且與宮頸癌患者的惡性狀態(tài)有顯著相關性。此外，lncRNA-TDRG1上調是宮頸癌患者預后不良的危險因素。然而，lncRNA-TDRG1在宮頸癌中的分子機制尚需進一步研究。