SIRT4在肝癌中的表達(dá)及其對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移的影響

韓麗麗，賈麗君，強(qiáng)昊琛，張淑群

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤病院，陜西西安 710004；2. 西安市曲江第一小學(xué)，陜西西安 710061)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是位居全球發(fā)病率第5位的惡性腫瘤[1]。肝癌細(xì)胞高增殖和高侵襲的生物學(xué)行為特點決定了肝癌起病隱匿、發(fā)展迅速、預(yù)后較差，其死亡率居全球第3位[2]。缺乏早期有效的預(yù)測生物標(biāo)記物以及治療手段是原發(fā)性肝癌預(yù)后較差的主要原因。

沉默調(diào)節(jié)蛋白Sirtuin(SIRT)家族是維持哺乳動物基因組穩(wěn)定的NAD+依賴的去乙酰化酶，乙酰化酶或ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶廣泛參與能量代謝和調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)[3]。家族成員包括SIRT1～SIRT7，7個家族成員表達(dá)異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[4]。以往研究熱點集中在SIRT1和SIRT2：SIRT1可通過對p53、DNA修復(fù)蛋白Ku70等去乙?；饔靡种颇[瘤發(fā)生；SIRT2表觀修飾H4K20進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期演進(jìn)維持基因組穩(wěn)定[5]。新近研究逐漸揭示位于線粒體內(nèi)的SIRT4有重要生物學(xué)作用。起初，SIRT4的研究熱點在于其調(diào)控脂肪酸氧化代謝和胰島素分泌的作用[6-8]；隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)SIRT4可調(diào)控谷氨酰胺代謝發(fā)揮抑制腫瘤的功能[9]；近期報道，SIRT4在胃癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤組織中均有表達(dá)下降的表現(xiàn)[10-12]。這些研究結(jié)果提示SIRT4可能參與抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是，SIRT4在人原發(fā)性肝癌中的表達(dá)水平以及與原發(fā)性肝癌的相關(guān)性研究鮮見報道。

本研究首次檢測SIRT4在肝癌組織及配對癌旁組織標(biāo)本中的表達(dá)水平，結(jié)合臨床病理資料分析SIRT4和肝癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系；利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)的SIRT4的肝癌細(xì)胞株，觀察SIRT4表達(dá)上調(diào)后對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，進(jìn)一步探討調(diào)控肝癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，為探尋新的肝癌生物標(biāo)記物和新的治療靶點提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院2010年3月至2011年3月HCC患者手術(shù)組織標(biāo)本120例，術(shù)前未接受放化療。所有組織標(biāo)本術(shù)后經(jīng)病理醫(yī)師查證，并凍存在液態(tài)氮中。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購自美國ATCC生物資源的中心。DMEM購自美國Thermo Fisher科技公司；胎牛血清購自美國Invitrogen公司；胰蛋白酶購自Sigma公司；RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司；Westernblot所用SIRT4、TGF-β、Vimentin、E-cadherin和GAPDH一抗購買于CST公司；二抗購買于北京博奧森公司；Transwell小室購自Millipore公司；慢病毒載體由吉凱公司提供包裝。

1.3 方法

1.3.1qRT-PCR檢測SIRT4的表達(dá) 應(yīng)用Trizol試劑提取臨床組織標(biāo)本或肝癌細(xì)胞總RNA，利用紫外分光光度計測試RNA純度和濃度；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)用于反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA。qRT-PCR條件：95 ℃預(yù)熱10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 5 s，重復(fù)40個周期。SIRT4相對表達(dá)情況采用2-△△Ct法對比GAPDH表達(dá)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物購自TaKaRa公司，其序列如下：5′-CCCTGACCTTGTAGATGTCATTG-3′(forward)和5′-GTCACGATGATACAG-TTCTGCAAA-3′(reverse)。所有實驗重復(fù)3次。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 在DMEM培養(yǎng)基(含150 mL/L胎牛血清)中，用于SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)，1.25 g/L胰酶用于細(xì)胞消化傳代。本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)感染SMMC-7721細(xì)胞，實驗分為SMMC-7721-NC陰性對照組和SMMC-7721-SIRT4過表達(dá)組。轉(zhuǎn)染前1 d將6×104/mL生長狀態(tài)良好的細(xì)胞平均接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞融合度均在10%～20%之間，病毒感染3～4 d后吸出培養(yǎng)基，按照MOI值為50(根據(jù)說明書推薦和預(yù)實驗結(jié)果)加入病毒稀釋液和完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d后觀察感染效果。加入3 μg/mL嘌呤霉素加壓篩選，單克隆細(xì)胞集落形成后，1.5 μg/mL的嘌呤霉素維持篩選擴(kuò)增。

本研究采用對照病毒為NC載體病毒，3個過表達(dá)SIRT4病毒的靶點：5′-GCACACTGGGCTTTGAGCTTG-3′和5′-CACAATCCAAGCACAGGA-G-3′；5′-GCCGCTAGAGGTGAAATTCTT-3′和5′-CATTCTTGGCAAATGCTTTC-3′；5′-GTCCACA-ATGTGCTACGTGCT-3′和5′-TGATCAACGAT-ACTTCGTTC-3′。

1.3.3MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 取對數(shù)生長期SMMC-7721-NC和SMMC-7721-SIRT4細(xì)胞，分別均勻接種于96孔板中，共設(shè)置5個復(fù)孔；分別于7 d同一時間檢測細(xì)胞增殖情況；第7天每孔加入5 mg/mL的MTT貯存液20 μL，繼續(xù)于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h后棄去上清液，加入150 μL的DMSO溶液，置于室溫避光反應(yīng)20 min，酶標(biāo)492 nm波長檢測吸光度值。

1.3.4Transwell小室實驗測定細(xì)胞遷移、侵襲能力 Transwell遷移實驗：100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基重懸1×104個肝癌細(xì)胞接種于Transwell小室上層，分組同前，設(shè)3個復(fù)孔；加入500 μL含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至Transwell小室下層；置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；取出小室，吸出上室內(nèi)培養(yǎng)基，用棉簽拭去小室上層殘存于聚碳酸酯膜上的細(xì)胞；40 g/L多聚甲醛液固定細(xì)胞15 min，結(jié)晶紫染色20 min；細(xì)胞超凈臺內(nèi)倒置風(fēng)干過夜，于光鏡下隨機(jī)觀察10個視野計數(shù)。Transwell侵襲實驗：首先用4 ℃的無血清DMEM稀釋Matrigel膠，稀釋比例為3∶1，取100 μL稀釋好的膠鋪滿小室上層，并于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h后可用于后續(xù)實驗；余步驟同遷移實驗。

1.3.5Western blot檢測SIRT4等表達(dá) 將實驗所用細(xì)胞在RIPA緩沖液中溶解，蛋白質(zhì)濃度由BCA進(jìn)行檢測。SDS-PAGE膠每孔加入總蛋白質(zhì)(25 g)，進(jìn)行蛋白電泳，隨后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。50 g/L的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗(SIRT4，1∶500；E-cadherin，1∶300，Vimentin，1∶500；TGF-β，1∶600；GAPDH，1∶3 000)，置于4 ℃冰箱過夜。TPBS清洗膜后加入二抗，37 ℃搖床放置2 h。最后使用DNR生物成像系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)光、測試、照相。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。獨(dú)立樣本t檢驗用于兩樣本間均數(shù)的比較，單因素方差分析及Dunnet檢測用于多組均數(shù)間比較，SIRT4與臨床病理參數(shù)采用χ2檢驗進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SIRT4在肝癌和配對癌旁組織中的表達(dá)及其與肝癌臨床病理特征的關(guān)系qRT-PCR結(jié)果提示，與配對的癌旁組織相比，肝癌組織中SIRT4表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2.18±0.11vs. 5.18±0.23,P<0.001)。進(jìn)一步對SIRT4的表達(dá)和臨床資料進(jìn)行分析，結(jié)果表明，SIRT4在67.5%(81/120)的HCC患者中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與肝癌患者的腫瘤大小(χ2=4.615,P=0.032)、微血管侵犯(χ2=12.001,P=0.001)及臨床分期有關(guān)(χ2=5.330,P=0.021)，與性別、年齡及組織病理分級等無相關(guān)性。

2.2 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SIRT4過表達(dá)慢病毒載體的SMMC-7721肝癌細(xì)胞系利用qRT-PCR方法檢測慢病毒載體4個靶點的過表達(dá)效果，結(jié)果顯示：3號靶點慢病毒過表達(dá)SIRT4效果最強(qiáng)(F=5.564,P=0.008，圖1A)，因而3號慢病毒載體被用于后續(xù)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。應(yīng)用3號慢病毒和LV-shNC分別轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，2～3周后熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染效率，85%以上觀察細(xì)胞呈現(xiàn)明亮綠色熒光，可見轉(zhuǎn)染效率在85%以上(圖1B)。

qRT-PCR結(jié)果提示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SIRT4過表達(dá)慢病毒載體的SMMC-7721細(xì)胞中SIRT4的mRNA表達(dá)水平與陰性對照組比較明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2.18±0.087vs. 1±0.073,P<0.001，圖1C)；Western blot結(jié)果顯示，在蛋白水平上，SMMC-7721-SIRT4組SIRT4表達(dá)水平較對照組明顯上調(diào)(1.087±0.095vs. 0.15±0.063,P=0.007，圖1D)。以上結(jié)果表明，SIRT4過表達(dá)的SMMC-7721細(xì)胞系構(gòu)建成功。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染SIRT4過表達(dá)載體后SMMC-7721中SIRT4表達(dá)水平上調(diào)

Fig.2 Up-regulated expression of SIRT4 in SMMC-7721-SIRT4 cells compared with SMMC-7721-NC cells

A：qRT-PCR檢測慢病毒載體4個靶點過表達(dá)效果，**P<0.01；B：熒光鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染效率(左為光鏡照片；右為熒光鏡照片)；C：qRT-PCR檢測SIRT4 mRNA表達(dá)，**P<0.01；D：Western blot檢測SIRT4蛋白表達(dá)。

2.3 SIRT4過表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響采用MTT法檢測了SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照空載體病毒及SIRT4過表達(dá)的慢病毒之后連續(xù)7 d的生長情況。結(jié)果顯示，與對照組(SMMC-7721-NC)比較，實驗觀察第5天至第7天過表達(dá)SIRT4的SMMC-7721細(xì)胞增殖能力明顯降低，其增殖能力明顯低于對照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(第5天：1.51±0.032vs. 2.99±0.097，P<0.001；第6天：1.98±0.089vs. 3.10±0.15，P<0.001；第7天：2.31±0.101vs. 3.98±0.34，P<0.001，圖2)。

圖2 MTT檢測過表達(dá)SIRT4對SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的影響

Fig.2 MTT assay results showed the effect of overexpression of SIRT4 on the proliferation ability of SMMC-7721 cells

與SMMC-7721-NC陰性對照組相比，*P<0.01。

2.4 SIRT4過表達(dá)對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響Transwell侵襲和遷移實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組(SMMC-7721-NC)相比，過表達(dá)SIRT4的SMMC-7721侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(21±4.87vs. 88±5.67,P=0.015；19±4.17vs. 86±4.99,P=0.021，圖3)。

2.5 SIRT4過表達(dá)對TGF-β和肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照組(SMMC-7721-NC)比，過表達(dá)SIRT4明顯降低了SMMC-7721細(xì)胞TGF-β(0.399±0.036vs. 0.98±0.023,P=0.010)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Vimentin表達(dá)水平(0.25±0.036vs. 0.99±0.034,P=0.030)，而代表上皮性的標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)明顯升高(2.16±0.064vs. 1.03±0.074,P=0.014，圖4)。

圖3 Transwell實驗檢測過表達(dá)SIRT4對SMMC-7721細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Fig.3 Transwell assay results showed that the effect of overexpression of SIRT3 on the invasion and migration ability of SMMC-7721 cells

A：Transwell小室實驗于顯微鏡下圖；B：SMMC-7721-SIRT4過表達(dá)組遷移細(xì)胞數(shù)明顯少于SMMC-7721-NC陰性對照組，**P<0.01；C：SMMC-7721-SIRT4過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯少于SMMC-7721-NC陰性對照組，**P<0.01。

圖4 SMMC-7721細(xì)胞中過表達(dá)SIRT4對TGF-β以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的影響

Fig.4 Effect of increased SIRT4 on the expression of TGF-β, Vimentin and E-cadherin

與SMMC-7721-NC陰性對照組相比，*P<0.05。

3 討 論

本研究結(jié)果首次提示，沉默調(diào)節(jié)蛋白SIRT4可能通過抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。與其他實體腫瘤相同，原發(fā)性肝癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素的過程，這個生物過程包含一系列抑癌基因失活和癌基因異常激活的參與[13]。肝癌發(fā)展過程中，多種與細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子信號發(fā)生異常表達(dá)或激活，這決定了肝癌高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特點，導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良。因此，深入研究篩選肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子，并探索其作用分子機(jī)制，尋找新的生物標(biāo)記物和新的治療靶點具有重要臨床價值。

SIRT4屬于SIRT家族，位于染色體12q24.23-q24.31，其編碼蛋白與酵母Sir4蛋白同源，具備sirtuin家族成員的共同特征——包括一個sirtuin核心領(lǐng)域，參與表觀修飾遺傳基因，導(dǎo)致其抑制、沉默和重組。新近研究表明，SIRT4通過調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝發(fā)揮抑癌作用，結(jié)腸癌、胃癌組織中SIRT4表達(dá)明顯下調(diào)[9]。然而，SIRT4在肝癌組織中的表達(dá)情況未見報道?；仡櫸墨I(xiàn)，SIRT的7個家族成員在不同的實體腫瘤類型中發(fā)揮的作用不盡相同[14]。例如，SIRT1在和皮膚癌、胃癌及前列腺癌中其表達(dá)異常升高[15-17]，提示SIRT1高表達(dá)與腫瘤進(jìn)程相關(guān)；SIRT1在乳腺癌中低表達(dá)；另外，WANG等[18]報道SIRT1可抑制小鼠模型腫瘤的形成，提示SIRT1在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。SIRT2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)降低，而在胰腺癌中表達(dá)卻升高，同樣提示SIRT2在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。以往報道提示，SIRT4在不同腫瘤均表現(xiàn)出抑癌基因的作用，例如，SIRT4抑制谷氨酰胺代謝，抑制HeLa細(xì)胞的生長；過表達(dá)SIRT4抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長；此外，SIRT4基因敲除小鼠模型更容易發(fā)生肺癌、乳腺癌以及淋巴瘤；SIRT4還可以抑制myc誘導(dǎo)的B淋巴瘤細(xì)胞生長[19]。本研究結(jié)果提示，SIRT4在肝癌組織中明顯下調(diào)，其低表達(dá)與更大的腫瘤大小、微血管侵犯及更高的腫瘤分期密切相關(guān)。進(jìn)一步的細(xì)胞實驗證實了肝癌細(xì)胞中過表達(dá)SIRT4抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示SIRT4在肝癌中同樣發(fā)揮抑癌基因作用。這是首次報道SIRT4在肝癌組織中的表達(dá)以及對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。

以往大量研究證實，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的基本機(jī)制[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，SIRT4過表達(dá)抑制TGF-β和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白。而TGF-β是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)控因子，因而我們推測，SIRT4可以通過抑制TGF-β抑制肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲。但是，其更深的調(diào)控機(jī)制尚未明確，這是本課題的局限，后續(xù)將進(jìn)一步探索SIRT4調(diào)控TGF-β的分子機(jī)制。

綜上所述，結(jié)合臨床組織樣本和細(xì)胞實驗的結(jié)果，我們的研究支持SIRT4在肝癌中發(fā)揮腫瘤抑制因子作用。同時，提示SIRT4是一個有前景的肝癌生物標(biāo)記物和有潛力的治療靶點。