Linc00460通過下調(diào)miR-654-3p在食管癌中發(fā)揮促癌作用

楊振威，趙 倩，莊 坤，韓 坤，和水祥，劉亞萍

(1. 西安市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710004；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710061)

依據(jù)SEER數(shù)據(jù)庫，食管癌患者的5年生存率僅19.2%，2018年的新發(fā)病例數(shù)為17 290例，而預(yù)計死亡數(shù)為15 850例；且在白人中腺癌(66%)的發(fā)病率遠(yuǎn)高于鱗癌(32%)[1-2]。而我國食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是食管癌的重要組織學(xué)類型，例如：林州市2003-2012年間鱗癌新發(fā)病例占總新發(fā)病例的85.3%[3]。因此，本研究納入了食管鱗癌患者。我國食管癌的發(fā)病率不容樂觀，賀宇彤等[4]通過分析全國腫瘤登記中心共255個腫瘤登記處的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)我國平均食管癌發(fā)病率為20.35/10萬，其中城市地區(qū)食管癌發(fā)病率為13.38/10萬，農(nóng)村地區(qū)為28.44/10萬。食管鱗癌的診治現(xiàn)狀也不太樂觀，很多患者在首診時處于晚期，常常有局部浸潤和轉(zhuǎn)移，已經(jīng)失去了手術(shù)機(jī)會[5]?，F(xiàn)階段對食管癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不清楚，難以發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)確的腫瘤標(biāo)志物用于食管癌的篩查[6]，亟待尋找新的食管鱗癌標(biāo)志物。

長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一系列長度大于200 nt的非編碼RNA，主要特點(diǎn)是缺少蛋白質(zhì)編碼功能[7]。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)已經(jīng)報道了許多l(xiāng)ncRNA參與腫瘤的發(fā)生，在腫瘤組織中異常表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，提示其有成為腫瘤標(biāo)志物的潛力[7-9]。lncRNA已被證明可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞行為，包括癌癥進(jìn)展、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和耐藥性[9]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，linc00460在食管鱗癌細(xì)胞中異常高表達(dá)，影響癌癥的發(fā)展和預(yù)后[10]。有基因芯片檢測結(jié)果提示linc00460在食管癌組織和正常組織之間有較大的變化；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提示其可能作為癌基因發(fā)揮功能，但其下游機(jī)制尚不清楚。通過starbase的預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)miR-654-3p很可能作為linc00460的下游發(fā)揮抑癌功能。既往研究提示miR-654-3p在甲狀腺癌中低表達(dá)，發(fā)揮著抑制甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的作用[11]；提示其可能具有抑癌基因的作用，但有關(guān)其在食管癌中的作用尚未見相關(guān)報道。本研究首次探索linc00460/miR-654-3p的調(diào)控關(guān)系，并且證實(shí)了其在食管癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，提示linc00460/miR-654-3p有作為食管癌腫瘤標(biāo)志物的潛力，但機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

1 資料與方法

1.1 食管癌患者臨床資料與分析標(biāo)本取自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010年至2013年病理證實(shí)的食管癌手術(shù)切除病例，收集121例食管癌術(shù)后組織標(biāo)本(食管癌組)及相應(yīng)癌旁組織(對照組)，并收集其臨床病理資料，研究已通過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)病理檢查首次確診為原發(fā)食管鱗癌；未合并其他腫瘤；患者一般情況良好，無嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等并發(fā)癥；術(shù)前無相關(guān)化療及放療；自愿參與本研究，并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)為：未簽署知情同意書；伴有其他嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病；既往已接受治療的患者；無手術(shù)指征的患者；為食管胃結(jié)合部腫瘤；患者主動要求退出。將121例食管癌患者分為linc00460高表達(dá)組及l(fā)inc00460低表達(dá)組，分析兩組患者間臨床指標(biāo)的差異，并進(jìn)行生存分析。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用食管癌KY-SE和Eca-109細(xì)胞系和正常食管HEEC細(xì)胞系(均購自ATCC公司)于37 ℃、50 mL/L CO2、950 mL/L濕度條件下，用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需的linc00460敲除慢病毒和miR-654-3p的過表達(dá)及敲除慢病毒均購買自上海吉凱公司。載體信息如下：上調(diào)載體hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin；下調(diào)載體hU6-MCS-CMV-EGFP。使用上述慢病毒，在Eca-109細(xì)胞系中分別構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)和低表達(dá)miR-654-3p細(xì)胞株及穩(wěn)定低表達(dá)linc00460細(xì)胞株。

1.3 CCK8實(shí)驗(yàn)收集處于對數(shù)期的Eca-109細(xì)胞，隨后調(diào)整細(xì)胞懸液種植于96孔板中(1×105/孔)，每孔添加細(xì)胞懸液100 μL，標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)孔；對照組則使用無菌PBS，標(biāo)記為對照孔。之后每孔中加入20 μL CCK-8溶液(5 mg/mL，上海碧云天)。分別于接種細(xì)胞后24、48、72 h時，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在A490 nm處測量實(shí)驗(yàn)孔與對照孔的吸光值。

1.4 RNA的提取和qRT-PCR使用Trizol試劑(Invitrogen公司)分別提取患者食管癌組織及培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄用15 μL RNA模板與2 μL RT引物(500 nmol/L)，在70 ℃ 10 min和4 ℃ 4 min后，加入5 μL RT緩沖液、足量的dNTPs、2 μL Mixture、0.5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶以及7.5 μL DEPC水。應(yīng)用SYBR Premix ExTaqTM實(shí)時定量PCR試劑盒，根據(jù)說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；60 ℃ 20 s，共30個循環(huán)。使用2-△△CT方法計算miR-654-3p和linc00460的表達(dá)水平。引物均購自TaKaRa(日本)。

1.5 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)構(gòu)建含有miR-654-3p預(yù)測位點(diǎn)的linc00460片段的熒光素酶報告基因(PGL3)。分別使用miR-654-3p+pGL3-linc00460-WT、miR-654-3p+pGL3-linc00460-Mut、miR-654-3p-NC+pGL3-linc00460-WT、miR-654-3p-NC+pGL3-linc00460-Mut轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞系。使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega)檢測細(xì)胞的熒光值。使用螢火蟲/海腎熒光值表示各組報告基因的激活水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析所有計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。qRT-PCR分析結(jié)果使用配對樣本t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用卡方檢驗(yàn)分析linc00460高表達(dá)組及l(fā)inc00460低表達(dá)組食管癌患者臨床指標(biāo)的差異，通過log-rank檢驗(yàn)及COX回歸模型進(jìn)行生存分析。通過R軟件繪制nomogram；使用C-index進(jìn)行nomogram的內(nèi)部檢驗(yàn)；所使用的R包為：“rms”、“Hmisc”、“l(fā)attice”、“survival”、“Formula”、“ggplot2”、“foreign”；R版本為3.4.1。

2 結(jié) 果

2.1 Linc00460及miR-654-3p在食管癌組織中的表達(dá)情況qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，Linc00460在121例食管鱗癌中相對癌旁組織(對照組)為高表達(dá)(t=4.23，P<0.05)；miR-654-3p在121例食管癌組織中相對癌旁組織(對照組)為低表達(dá)(t=7.82，P<0.05，圖1)?？ǚ綑z驗(yàn)提示miR-654-3p在linc00460高表達(dá)組和低表達(dá)組中表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)；linc00460表達(dá)情況與T、N分期相關(guān)(P<0.05，表1)。

圖1 食管癌組織和癌旁組織中l(wèi)inc00460(A)及miR-654-3p(B)的表達(dá)

Fig.1 Expressions of linc00460 (A) and miR-654-3p (B) in esophageal cancer and para-cancer tissues

**P<0.01。

2.2 Linc00460及miR-654-3p的生存分析Log-rank分析提示，linc00460高表達(dá)與食管鱗癌較差的預(yù)后有關(guān)，而miR-654-3p高表達(dá)與食管鱗癌較好的預(yù)后有關(guān)(表2)。

2.3 Linc00460及miR-654-3p的nomogram依據(jù)與預(yù)后相關(guān)的因素(表2)建立COX模型，提示N分期、linc00460與食管鱗癌不良預(yù)后有關(guān)，而miR-654-3p與食管鱗癌良好預(yù)后有關(guān)(表3)。對N分期、linc00460級miR-654-3p繪制nomogram(圖2)，提示miR-654-3p對食管鱗癌的預(yù)后的影響最大。一致性檢驗(yàn)C-index為0.734(0.633～0.852)，提示該nomogram可信度良好。

表1 Linc00460表達(dá)與食管癌患者臨床特征的相關(guān)性

Tab.1 The association of linc00460 expression level with clinical characteristics of esophageal cancer patients

臨床特征nlinc00460低表達(dá)組(n=30)linc00460高表達(dá)組(n=91)P性別 女571641 0.594 男641450年齡(歲) ≥60781860 0.633 <60431231T分期 T1762155<0.001 T228721 T317215N分期 N0822458<0.001 N1-339633miR-654-3p表達(dá) 高18171<0.001 低1031390

表2 121例食管癌患者的預(yù)后分析

Tab.2 Log-rank test of the 121 esophageal cancer patients

變量總生存期(月)P性別 女26.32±3.21 男25.31±2.18 0.82年齡(歲) ≥6027.13±2.99 <6023.18±3.35 0.72T分期 T131.21±3.19 T228.25±4.97 T317.33±4.21<0.05N分期 N032.17±3.77 N1-314.25±5.18<0.05Linc00460表達(dá) 高23.13±2.13 低28.55±3.62<0.05miR-654-3p表達(dá) 高33.29±1.35 低22.25±2.33 0.05

表3 121例食管癌患者建立COX模型

Tab.3 COX model for the 121 esophageal cancer patients

變量HRPN分期<0.05 N0Reference N1-33.28(2.19～4.51)Linc00460表達(dá)<0.05 低Reference 高6.18(4.89～8.33)miR-654-3p表達(dá)<0.05 低Reference 高0.37(0.19～0.58)

圖2 121例食管鱗癌患者的nomogram

Fig.2 Nomogram of the 121 patients with esophageal squamous cell carcinoma

2.4 Linc00460及miR-654-3p在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)及促癌功能Linc00460在食管癌細(xì)胞中高表達(dá)，而miR-654-3p則為低表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)提示，敲除linc00460的Eca-109細(xì)胞的增殖能力顯著降低；過表達(dá)miR-654-3p的Eca-109細(xì)胞的增殖能力顯著降低；而敲除miR-654-3p的Eca-109細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)(圖3)。

圖3 Linc00460及miR-654-3p在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)及對細(xì)胞增殖能力的影響

Fig.3 Expressions of linc00460 and miR-654-3p in esophageal cancer cells and the effects on proliferation

A、B：linc00460、miR-654-3p在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)，***P<0.001；C～E：CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測敲除linc00460、過表達(dá)miR-654-3p及抑制miR-654-3p的Eca-109細(xì)胞的增殖能力。與control比較，***P<0.001。

2.5 Linc00460通過直接調(diào)控miR-654-3p發(fā)揮生物學(xué)功能敲除linc00460的miR-654-3p表達(dá)明顯升高；而敲除和過表達(dá)miR-654-3p時，linc00460的表達(dá)未見明顯改變(圖4A～C)，提示miR-654-3p可能是linc00460的下游靶點(diǎn)。進(jìn)一步雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)顯示，linc00460的3′UTR區(qū)域與miR-654-3p直接結(jié)合(圖4D)。

3 討 論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在腫瘤組織中異常表達(dá)，LncRNA在癌癥中的作用一直備受關(guān)注[12]。國內(nèi)外文獻(xiàn)均證實(shí)lncRNA調(diào)控在ESCC的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，而且與患者的預(yù)后息息相關(guān)[13]。由此，人們提出lncRNA有成為腫瘤標(biāo)志物的潛力。Linc00460位于染色體13q33.2，在多種腫瘤中高表達(dá)，例如結(jié)直腸癌、鼻咽癌、肺腺癌等[14-18]。YE等[19]學(xué)者通過分析TCGA肺腺癌數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，linc00460過表達(dá)患者預(yù)后顯著低于linc00460低表達(dá)的患者。進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，敲除linc00460后可以顯著抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖能力。

圖4 Linc00460和miR-654-3p的互相調(diào)控關(guān)系

Fig.4 Regulation relationship between linc00460 and miR-654-3p

A：qRT-PCR檢測敲除linc00460時miR-654-3p的表達(dá)；B：qRT-PCR檢測敲除miR-654-3p時linc00460的表達(dá)；C：qRT-PCR檢測過表達(dá)miR-654-3p時linc00460的表達(dá)；D：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測linc00460與miR-654-3p直接結(jié)合。**P<0.01。

本研究發(fā)現(xiàn)linc00460在食管鱗癌中有促癌作用，提示linc00460可能為食管鱗癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

為明確linc00460在ESCC中作用的具體分子機(jī)制，本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)敲除ESCC細(xì)胞中的linc00460。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌細(xì)胞增殖能力被顯著抑制?？紤]到lncRNA可作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)，通過競爭性結(jié)合microRNA，調(diào)控下游基因表達(dá)，影響相應(yīng)生物學(xué)功能[20]。因此，我們依據(jù)生物信息學(xué)網(wǎng)站Starbase V2.0，Targetscan，預(yù)測發(fā)現(xiàn)linc00460與miR-654-3p的序列存在互補(bǔ)區(qū)域，即linc00460可能通過下調(diào)miR-654-3p發(fā)揮功能。進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，linc00460與miR-654-3p的表達(dá)存在負(fù)性關(guān)系。敲除linc00460后，miR-654-3p表達(dá)出現(xiàn)上升。雙熒光素酶報告結(jié)果證實(shí)，linc00460與miR-654-3p存在直接結(jié)合關(guān)系。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)生的、長度約20～24個核苷酸的小RNA，通過與其具有互補(bǔ)片段的mRNA，參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[21]。miR-654-3p在乳頭狀甲狀腺癌及肺腺癌中均表現(xiàn)出抑癌功能[22-23]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，miR-654-3p在ESCC中表達(dá)低于癌旁組織，這與miR-654-3p在其他腫瘤中所發(fā)揮的生物學(xué)功能一致。進(jìn)一步生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，過表達(dá)miR-654-3p可抑制ESCC細(xì)胞的增殖能力；在linc00460過表達(dá)的ESCC細(xì)胞中，其過表達(dá)可抑制linc00460的促癌能力，進(jìn)一步證明linc00460/ miR-654-3通路參與了ESCC的發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，linc00460高表達(dá)及miR-654-3p低表達(dá)可作為ESCC患者預(yù)后較差的指標(biāo)。為了更好將基礎(chǔ)研究結(jié)合于臨床實(shí)踐，本研究收集并整理了相應(yīng)121例ESCC患者的臨床病理資料，并依據(jù)linc00460及miR-654-3p的表達(dá)水平繪制nomogram圖。nomogram圖是對多因素COX回歸的可視化表現(xiàn)，患者本人或臨床醫(yī)師可依據(jù)nomogram圖對每一項(xiàng)危險因素進(jìn)行評估，并預(yù)測每一位患者相應(yīng)的3年或5年生存率。通過nomogram圖結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，miR-654-3p對食管鱗癌的預(yù)后貢獻(xiàn)最大。一致性檢驗(yàn)C-index提示該nomogram可信度良好。

本研究發(fā)現(xiàn)，linc00460通過與miR-654-3p直接結(jié)合下調(diào)miR-654-3p，促進(jìn)ESCC的發(fā)生發(fā)展；此外，通過對121例ESCC患者繪制nomogram圖，發(fā)現(xiàn)miR-654-3p對食管鱗癌的預(yù)后貢獻(xiàn)最大?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，后期研究可進(jìn)一步探討miR-654-3p及miR-654-3p下游靶基因在ESCC中所發(fā)揮的作用，進(jìn)一步闡明linc00460/miR-654-3p的分子機(jī)制。