褪黑素通過Nrf2/HO-1信號通路減輕大鼠腦缺血再灌注損傷

鞏敏杰，安佳琪，吳 鋒，唐永蘭，祁 藝，袁惠婕，羅國剛

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西西安 710061)

缺血性腦卒中是我國最常見的腦卒中類型，具有高病死率、致殘率。目前治療缺血性腦卒中最有效的方法是血管再通治療[1]，但血管再通后存在缺血再灌注損傷[2]。褪黑素是松果體釋放的色氨酸代謝產(chǎn)物，除了調(diào)節(jié)睡眠外，還是一種高效的自由基清除劑[3]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后給予褪黑素可以明顯減少梗死體積[4]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素對腦缺血再灌注的保護作用主要是直接對氧自由基的清除和間接提高抗氧化應(yīng)激蛋白的表達，但具體機制仍不明確[5]。核因子-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是內(nèi)源性抗氧化防御的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，可以促進多種抗氧化基因轉(zhuǎn)錄，包括血紅素氧化酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2能減輕腦缺血再灌注損傷，且Nrf2對腦缺血再灌注的保護作用也是通過調(diào)控下游抗氧化蛋白實現(xiàn)的[7]，但褪黑素對Nrf2/HO-1調(diào)控的研究甚少。因此，本研究旨在探討腦缺血再灌注損傷后褪黑素處理的保護作用及褪黑素對Nrf2/HO-1的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組250～300 g雄性SD大鼠99只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，并獲得西安交通大學(xué)動物實驗管理委員會批準(zhǔn)。實驗中大鼠飼養(yǎng)于室溫(24±1)℃、相對濕度(45±5)%、日光燈照射12 h明暗交替的標(biāo)準(zhǔn)動物房,動物自由攝食、飲水。將99只SD大鼠編號并按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、褪黑素處理組，每組33只。

1.2 主要試劑及器材線栓(北京西濃科技有限公司)，尼氏染液(西安赫特生物)，Nrf2(Abcam公司)，HO-1(Proteintech公司)，β-actin(博奧森生物技術(shù)有限公司)，褪黑素(Sigma公司)

1.3 腦缺血再灌注模型的制作及評價參照LONGA等[8]的造模方法，70 g/L水合氯醛5 mL/kg腹腔注射全身麻醉，分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈及頸總動脈近心端，從頸總動脈遠心端將線栓從頸總動脈分叉處送至頸內(nèi)動脈(18±2)mm，90 min后拔出線栓造成再灌注損傷。假手術(shù)組暴露并結(jié)扎血管但未插入線栓。動物麻醉清醒后，參照longa5級評分法選取模型動物：0分，無神經(jīng)損傷；1分，提尾時對側(cè)前肢內(nèi)收屈曲；2分，爬行時向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分，站立或爬行時向?qū)?cè)傾倒；4分，無自主活動伴意識喪失。選取1～2分的大鼠為成功的動物模型。

1.4 給藥方法褪黑素溶于3.43 mol/L無水乙醇生理鹽水溶液中，褪黑素處理組在灌注即刻和12 h后按5 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射褪黑素，腦缺血再灌注組腹腔注射3.43 mol/L無水乙醇生理鹽水溶液,藥物處理至1、3、7 d。

1.5 神經(jīng)功能評分實驗動物在褪黑素處理1、3、7 d后采用改良Garcia JH評分評價大鼠神經(jīng)功能缺損情況，改良Garcia JH評分包括自主運動、體態(tài)、前肢伸展運動、抓持和攀爬鐵籠的能力、兩側(cè)身體觸覺反射和兩側(cè)胡須觸碰反應(yīng)6部分內(nèi)容，可以全面評估大鼠神經(jīng)功能情況。得分越高神經(jīng)功能越好，最高分18分。

1.6 尼氏染色二甲苯2次10 min脫蠟，無水乙醇2次5 min，16.3 mol/L乙醇和14.6 mol/L乙醇各3 min，自來水沖洗后用蒸餾水漂洗，后用37 ℃預(yù)熱的尼氏染色液染色8 min，蒸餾水漂洗后脫水、透明中性樹膠封片。

1.7 HE染色將大鼠用PBS灌注后用40 g/L多聚甲醛固定，腦組織后固定48 h后常規(guī)石蠟包埋后切片，依次脫蠟、脫水、蘇木素及伊紅染色，后脫水透明中性樹膠封片。

1.8 免疫組化法檢測Nrf2及HO-1的表達將大鼠用PBS灌注后用40 g/L多聚甲醛固定，后固定48 h后常規(guī)石蠟包埋后切片，依次脫蠟、脫水后，30 mL/L H2O2溶液浸泡20 min，自來水沖洗，檸檬酸抗原微波修復(fù)20 min，自然冷卻至室溫后，BSA室溫封閉30 min，一抗4 ℃過夜，PBS 3次5 min漂洗，二抗37 ℃孵育30 min，PBS 3次5 min漂洗后DAB顯色，蘇木素復(fù)染、氨水返藍，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.9 Western blot方法檢測Nrf2及HO-1的表達將大鼠用預(yù)冷的PBS灌注后，斷頭取腦，參照ASHWAL等[9]的方法取大鼠腦缺血半暗帶，在距額葉前端3 mm和9 mm處做冠狀切割，取中間6 mm厚的腦組織塊，然后沿此腦塊矢狀縫兩側(cè)旁開2 mm處切去中間區(qū)域，后沿矢狀切面旁開2 mm處，并和矢狀切面呈30度夾角斜切，內(nèi)側(cè)皮層即為缺血半暗帶。冰上裂解30 min提取蛋白，測定蛋白濃度后煮樣。設(shè)置80 V、30 min，110 V、120 min進行電泳，轉(zhuǎn)膜后50 g/L脫脂奶粉封閉80 min，用TBST稀釋一抗(Nrf2，1∶1 000；HO-1，1∶2 000)，4 ℃過夜孵育，3次10 min洗膜后加二抗(1∶5 000)室溫孵育80 min，3次10 min洗膜后，使用ECL發(fā)光系統(tǒng)顯像。使用Image J軟件進行灰度值(DPI)分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理本研究中所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析，用Graphpad Prism6.0繪制所有圖表，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠改良Garcia JH評分褪黑素處理1 d、3 d和7 d時根據(jù)GARCIA等[10]的神經(jīng)缺損評分法對3組大鼠進行神經(jīng)缺損評分，對3組數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA分析。對比3組數(shù)據(jù)可見，褪黑素處理組在3個時間的神經(jīng)評分均較缺血再灌注組高(P<0.05，圖1)。

圖1 改良Garcia JH評分Fig.1 Modified Garcia JH scoreA:1d時,與腦缺血再灌注組比較,**P<0.01;B:3d時,與腦缺血再灌注組比較,*P<0.05;C:7d時,與腦缺血再灌注組比較,***P<0.001;D:各組大鼠神經(jīng)功能評分變化趨勢。

2.2 各組大鼠腦梗死面積的比較在1 d時用尼氏染色法觀察腦梗死面積，用梗死面積比同側(cè)總腦面積發(fā)現(xiàn)，與腦缺血再灌注組相比，褪黑素處理組梗死面積占病灶側(cè)腦面積比值較小(圖2)。

2.3 腦梗死灶神經(jīng)元形態(tài)的變化低倍鏡下假手術(shù)組無梗死組織，腦缺血再灌注組和褪黑素處理組可見染色較淺的梗死灶區(qū)和染色較深的正常區(qū)域。高倍鏡下可見假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)完整及尼氏體；而缺血再灌注組梗死灶神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)消失，神經(jīng)元皺縮，樹突及尼氏體消失；褪黑素處理組神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)消失但大體形態(tài)仍存在，神經(jīng)元皺縮較缺血再灌注組程度輕(圖3)。

2.4 褪黑素處理24 h后各組Nrf2和HO-1表達變化各組大鼠在24 h后，Western blot檢測Nrf2、HO-1和β-actin蛋白含量，并進行灰度值分析(DPI)，進一步分別計算Nrf2、HO-1的相對表達量。結(jié)果顯示，在24 h時與腦缺血再灌注組相比，褪黑素處理組Nrf2表達量較高，但無統(tǒng)計學(xué)意義；褪黑素處理組的HO-1較腦缺血再灌注組表達量高(P<0.05，圖4)。

圖2 梗死面積

Fig.2 Area of cerebral infarction

A：假手術(shù)組；B：腦缺血再灌注組；C：褪黑素處理組。白色虛線框選的區(qū)域為梗死區(qū)域。

圖3 大鼠腦梗死灶神經(jīng)元形態(tài)的變化

Fig.3 Morphological changes of neurons in cerebral infarction

A～C分別為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、褪黑素處理組10×10倍鏡下的組織形態(tài)；D～F分別為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、褪黑素處理組10×40倍鏡下的組織形態(tài)?！鳛楣Ｋ涝顓^(qū)，↑為神經(jīng)元。

圖4 各組大鼠腦缺血半暗帶Nrf2和HO-1的表達變化

Fig.4 Expression levels of Nrf2 and HO-1 in cerebral ischemic penumbra of rats

A：各組大鼠缺血半暗帶HO1和Nrf2的表達，1～3分別為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、褪黑素處理組；B：各組大鼠腦缺血半暗帶Nrf2的相對表達比較，ns：組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；C：3組大鼠腦缺血半暗帶HO-1相對表達比較，與腦缺血再灌注組相比較，*P<0.05。

2.5 HO-1表達情況用免疫組化的方法檢測HO-1表達情況，結(jié)果顯示，假手術(shù)組在低倍鏡下可見較少散在的陽性細胞，而腦缺血再灌注組和褪黑素處理組在低倍鏡下可見HO-1主要表達在梗死灶與正常組織交界處，而褪黑素處理組后增加了陽性細胞的表達范圍(圖5)。

2.6 褪黑素處理3 d后各組Nrf2和HO-1表達變化各組大鼠在3 d后，用Western blot方法檢測Nrf2、HO-1和β-actin蛋白含量，并進行灰度值分析(DPI)，進一步分別計算Nrf2、HO-1相對表達量。結(jié)果顯示，3 d時在梗死核心區(qū)褪黑素處理組Nrf2較腦缺血再灌注組表達量高(P<0.05)；3 d時在梗死核心區(qū)褪黑素處理組HO-1較腦缺血再灌注組表達量高(P<0.001，圖6)。而在梗死灶周圍褪黑素處理組HO-1較腦缺血再灌注組表達量高(P<0.001)，Nrf2表達量較腦缺血再灌注組表達量高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(圖7)。

2.7 各組GFAP和NF200的表達情況在3 d和7 d兩個時間點，假手術(shù)組GFAP可見散在的陽性細胞，腦缺血再灌注組可見大量GFAP陽性細胞，這些陽性細胞胞體肥大、突起增粗、延長，褪黑素處理組也可見大量GFAP陽性細胞，但陽性細胞數(shù)量較腦缺血再灌注組少，陽性細胞胞體肥大、突起增粗、延長不如腦缺血再灌注組明顯(圖8)。假手術(shù)組3 d和7 d兩個時間點NF200陽性細胞較少，腦缺血再灌注組和褪黑素處理組在3 d和7 d可見大量NF200陽性細胞，但腦缺血再灌注組在3 d和7 d的陽性細胞較褪黑素處理組少(圖9)。

圖5 大鼠腦組織HO-1的表達情況

Fig.5 HO-1 expression in rat brain tissues

A～C分別為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、褪黑素處理組10×10倍鏡下HO-1陽性細胞；D～F分別為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、褪黑素處理組10×20倍鏡下HO-1陽性細胞?！骱头謩e為梗死灶區(qū)和正常區(qū)域，↑為陽性細胞。

圖6 各組大鼠3 d時梗死核心區(qū)Nrf2、HO-1表達變化

Fig.6 The expression levels of Nrf2 and HO-1 in the infarct area of rats at 3 d

A：褪黑素處理3 d后各組的梗死核心區(qū)HO-1和Nrf2表達，1～3分別為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、褪黑素處理組；B：3組大鼠Nrf2的相對表達比較，與腦缺血再灌注組比較，*P<0.05；C：3組大鼠HO-1的相對表達，與腦缺血再灌注組比較，***P<0.001。

圖7 各組大鼠3 d時的梗死核心區(qū)與正常組織交界處Nrf2、HO-1表達

Fig.7 The expression levels of Nrf2 and HO-1 at the junction of infarct and normal tissues after 3 d

A：3 d時各組的梗死核心區(qū)與正常組織交界處HO-1和Nrf2表達，1～3分別為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、褪黑素處理組；B：3組大鼠Nrf2的相對表達比較，ns：組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；C：3組大鼠HO-1的相對表達比較，與腦缺血再灌注組相比，***P<0.001。

圖8 褪黑素處理3 d和7 d時3組大鼠腦組織梗死灶周圍GFAP表達情況

Fig.8 The expression of GFAP after melatonin treatment for 3 and 7 days (×400)

A、B、C分別為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組和褪黑素處理組在3 d時的GFAP的表達情況；D、E、F分別為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組和褪黑素處理組在7 d時GFAP的表達情況。↑為GFAP陽性細胞。

圖9 褪黑素處理3 d和7 d時各組大鼠腦組織梗死灶周圍NF200表達情況

Fig.9 The expression of NF200 after melatonin treatment for 3 and 7 days (×200)

A、B、C分別為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組和褪黑素處理組在3 d時的NF200的表達情況；D、E、F分別為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組和褪黑素處理組在7 d時NF200的表達情況?！鼮镹F200陽性細胞。

3 討 論

缺血性腦卒中是因顱腦血管阻塞引起腦血流供應(yīng)障礙，進而造成腦組織缺血缺氧性壞死，出現(xiàn)突發(fā)神經(jīng)功能缺損的疾病，血管再通后往往會發(fā)生再灌注損傷[11]。目前認為，再灌注損傷與氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸釋放等有關(guān)[12]。研究表明，Nrf2在氧化應(yīng)激造成的再灌注損傷中具有重要的保護作用。ZHAO等[13]發(fā)現(xiàn)，小鼠永久性腦梗死模型中缺血區(qū)皮質(zhì)的Nrf2和下游蛋白HO-1等的表達量在24 h時明顯上升；然而，TANAKA等[14]發(fā)現(xiàn)，在小鼠腦缺血再灌注模型中Nrf2的表達是一個動態(tài)變化過程，半暗帶Nrf2在2 h時表達增高，在8 h時達到頂峰，而在24 h和72 h時已經(jīng)表達量開始下降。在正常情況時，Nrf2位于細胞質(zhì)中與keap1而很快被降解，當(dāng)細胞在腦缺血過程中受到氧化應(yīng)激時，Nrf2與Keap1分離，進入細胞核，并與ARE序列結(jié)合，從而上調(diào)其靶基因的表達，保護腦組織[15]。HO-1是Nrf2的下游蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1在腦缺血再灌注損傷中具有重要作用。CUI等[16]發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注24 h時HO-1表達量上升，而LIU等[17]發(fā)現(xiàn)，永久性腦梗死模型中HO-1的高表達可持續(xù)至少3 d。本研究發(fā)現(xiàn)，在24 h時腦缺血再灌注組Nrf2表達減低，在3 d的表達量與假手術(shù)組無差異，這與TANAKA等的研究一致，而腦缺血再灌注組HO-1的高表達持續(xù)至3 d，這與LIU等[17]的研究一致。

褪黑素是松果體分泌的一種神經(jīng)激素，它具有廣泛的調(diào)節(jié)和保護作用，如同步晝夜節(jié)律，防止氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)能量代謝，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，延緩衰老過程等[18]。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的褪黑素對缺血性腦卒中均有保護作用。LI等[19]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可通過降低再灌注后Nox2和Nox4的表達抑制ROS生成，減輕氧化應(yīng)激損傷，保護腦組織；BHATTACHARYA[20]等發(fā)現(xiàn)，褪黑素保護缺血性腦卒中可能與梗死區(qū)AQP4下調(diào)后減輕腦水腫有關(guān)；WEI等[21]的研究提示，褪黑素通過激活Yap-Hippo通路，降低腦再灌注應(yīng)激保護腦組織。然而，褪黑素保護腦缺血再灌注損傷的機制仍不明確。目前對于褪黑素參與調(diào)控腦缺血后Nrf2/HO-1的研究甚少。本研究在再灌注即刻和再灌注12 h后對模型大鼠腹腔注射5 mg/kg褪黑素7 d發(fā)現(xiàn)，褪黑素能夠改善模型大鼠的神經(jīng)功能，同時褪黑素能增加1 d和3 d時Nrf2和HO-1的表達量，提示褪黑素對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能通過Nrf2/HO-1信號通路。

神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)反映星形膠質(zhì)細胞增生活化，但大量GFAP的堆積是星形膠質(zhì)細胞參與膠質(zhì)瘢痕形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[22]。星形膠質(zhì)細胞的過度增殖活化會促進膠質(zhì)瘢痕形成，對軸突的再生具有阻礙作用,不利于神經(jīng)功能的恢復(fù)[23]。WANG等[24]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能減輕星形膠質(zhì)細胞的活化。本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素處理至3 d和7 d時能減少GFAP的生成，這與上述研究結(jié)果一致。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NF200反映神經(jīng)軸突的生長[25]。我們發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)活化程度較低時，反應(yīng)軸突生長的NF200生成較多，說明褪黑素處理可以減輕腦卒中后星形膠質(zhì)細胞的增殖活化，促進神經(jīng)軸突生長。

綜上所述，本研究認為，在腦缺血再灌注時即刻5 mg/kg褪黑素處理，對腦缺血再灌注有保護作用，可能是因為提高了內(nèi)源性抗氧化防御調(diào)控因子Nrf2和下游蛋白HO-1的表達量；同時發(fā)現(xiàn)，褪黑素處理3 d和7 d后可以減輕星形膠質(zhì)細胞的增殖活化，促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。