IL-17A通過p38MAPK通路抑制巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白的降解

馬望歌，周 棟，王麗君，劉 艷，陳小莉，郭 寧，周 娟, 2

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710061；2. 陜西省分子心臟病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061；3. 漢中市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西漢中 723000)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是心血管系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。AS的發(fā)生與機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)及局部自由基增加等因素有關(guān)，其中免疫炎癥機(jī)制在AS發(fā)生發(fā)展中的作用越來越被研究者認(rèn)可[1]。當(dāng)機(jī)體動(dòng)脈內(nèi)膜受到損傷時(shí)，損傷部位的內(nèi)皮細(xì)胞、粘附的血細(xì)胞可以釋放粘附分子，進(jìn)而誘導(dǎo)血液中的單核細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜，并轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞[2]。巨噬細(xì)胞通過膜表面的清道夫受體可以大量攝取氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)。正常情況下，這些被攝取進(jìn)巨噬細(xì)胞的ox-LDL經(jīng)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化而排出。但當(dāng)巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇的攝取、酯化和排出的動(dòng)態(tài)平衡被打破時(shí)，脂質(zhì)將大量在胞內(nèi)積聚，并進(jìn)一步形成巨噬細(xì)胞源性的泡沫細(xì)胞，這是AS形成的初始步驟[3]。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(adenosine triphosphate binding cassette transporter A1, ABCA1)可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的流出及穩(wěn)態(tài)維持，其主要通過促進(jìn)膽固醇及磷脂從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外貧脂的載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I, ApoA-I)，并形成前-β高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)，從而減少胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積，是機(jī)體抗AS的重要分子之一[4]。

白細(xì)胞介素17(interleukin-17, IL-17)是體內(nèi)一種重要的細(xì)胞因子，在炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病等的發(fā)病進(jìn)程中均發(fā)揮重要作用[5-6]。IL-17家族由IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E等6個(gè)成員構(gòu)成，IL-17A是其中最為重要的成分。有研究顯示，AS斑塊局部的IL-17表達(dá)上升[7]。但有關(guān)IL-17在AS病程中的確切作用目前仍無定論[8]。本課題組前期研究結(jié)果提示，IL-17A可上調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)，在一定程度說明其抗AS作用。本研究將進(jìn)一步探討IL-17A上調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑Raw264.7細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，放線菌酮購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，ABCA1抗體購(gòu)自美國(guó)Novus公司，p-p38MAPK、泛素(ubiquitin)及β-actin抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，Protein A/G PLUS-Agarose和SB203580購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組Raw264.7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，50 mL/L CO2、37 ℃孵箱培養(yǎng)。1～2 d換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，2.5 g/L胰酶消化，1∶5傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞種植于6孔培養(yǎng)板中。

干預(yù)前用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞14～16 h。用10、20、50 ng/mL IL-17A干預(yù)，確定最適濃度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。即與10 μg/mL蛋白酶抑制劑放線菌酮(cycloheximide, CHX)同時(shí)加入無血清培養(yǎng)基中，分別干預(yù)Raw264.7細(xì)胞0.5、1、2、4 h進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。此外，將IL-17A抑制劑SB203580單獨(dú)干預(yù)或先于IL-17A 0.5 h置于培養(yǎng)基中聯(lián)合干預(yù)，觀察p38MAPK通路的作用。

1.3 Western blot檢測(cè)ABCA1、p-38MAPK蛋白的表達(dá)情況吸出各組培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS漂洗2次，加入蛋白裂解混合液(RIPA)裂解細(xì)胞，并提取蛋白進(jìn)行蛋白定量。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，50 mL/L脫脂牛奶封閉后滴加一抗(ABCA1，p-p38MAPK，ubiquitin，工作液均為1∶1 000稀釋；內(nèi)參β-actin為1∶10 000稀釋)孵育、4 ℃過夜，經(jīng)二抗孵育后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯色。β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。

1.4 免疫共沉淀檢測(cè)ABCA1蛋白泛素化水平提取各組細(xì)胞總蛋白，加入20 μL Protein A/G PLUS-Agarose 4 ℃孵育30 min，離心去除瓊脂糖珠，測(cè)定樣品濃度后，取100 μg樣品加入1 μg ABCA1抗體和20 μg Protein A/G PLUS-Agarose，4 ℃搖床過夜，離心后，60 μL 2×上樣緩沖液重懸后煮沸變性，其余操作同Western blot(一抗：ubiquitin 1∶1 000)。

2 結(jié) 果

2.1 巨噬細(xì)胞ABCA1的表達(dá)情況不同濃度IL-17A干預(yù)Raw264.7細(xì)胞，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白在10、20、50 ng/mL的IL-17A的干預(yù)時(shí)，表達(dá)水平呈增高趨勢(shì)，與未干預(yù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 Western blot檢測(cè)不同濃度的IL-17A對(duì)RAW264.7細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)的影響

Fig.1 The effects of IL-17A on the protein expression of ABCA1 in RAW264.7 macrophages

與IL-17A未干預(yù)組(0 ng/mL)比較，*P<0.01。

用不同濃度的IL-17A干預(yù)細(xì)胞，與對(duì)照組相比，10、20、50 ng/mL的IL-17A干預(yù)對(duì)Raw264.7細(xì)胞ABCA1 mRNA的表達(dá)均無影響(結(jié)果未顯示)。上述結(jié)果表明，IL-17A可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)，但這種表達(dá)的增高并不發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。

2.2 IL-17A可抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)ABCA1蛋白質(zhì)的降解Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-17A聯(lián)合干預(yù)組RAW264.7細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)在0.5、1、2 h均高于同一時(shí)間點(diǎn)CHX單獨(dú)干預(yù)組(P<0.05，圖2)，表明IL-17A可以通過抑制ABCA1的降解，從而增加其蛋白表達(dá)水平。

圖2 IL-17A可以抑制RAW264.7細(xì)胞中ABCA1蛋白的降解

Fig.2 The protein expression of ABCA1 in RAW264.7 macrophages treated by IL-17A when protein synthesis was inhibited by CHX

與相同時(shí)間點(diǎn)CHX單獨(dú)干預(yù)組比較，*P<0.05。

2.3 IL-17A可抑制巨噬細(xì)胞ABCA1與ubiquitin蛋白的結(jié)合免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，在20 ng/mL的IL-17A干預(yù)組細(xì)胞在ABCA1表達(dá)增多的情況下，ABCA1蛋白與ubiquitin結(jié)合的程度減少(圖3)，提示其泛素化程度降低。說明IL-17A主要通過抑制ABCA1蛋白的泛素化降解過程，從而增高其表達(dá)。

2.4 IL-17A通過p38MAPK途徑抑制ABCA1蛋白的泛素化降解進(jìn)一步給予Raw264.7細(xì)胞p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理30 min，結(jié)果表明，20 ng/mL的IL-17A可明顯升高細(xì)胞p38MAPK的磷酸化水平(P<0.05)，而2 μmol/L的SB203580預(yù)處理可使其磷酸化水平明顯降低(P<0.05)。同時(shí)，SB203580預(yù)處理還可顯著降低細(xì)胞因IL-17A干預(yù)而增加的ABCA1蛋白的表達(dá)水平(圖4)。

圖3 IL-17A可減少ABCA1蛋白與泛素的結(jié)合

Fig.3 The ubiquitination of ABCA1 protein in RAW264.7 macrophages treated by IL-17A

圖4 p38MAPK抑制劑可逆轉(zhuǎn)IL-17A對(duì)巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)的增高作用

Fig.4 The role of p38MAPK in upregulating ABCA1 protein induced by IL-17A in RAW264.7 macrophages

與IL-17A未干預(yù)組比較，*P<0.05。

應(yīng)用SB203580預(yù)處理細(xì)胞后，檢測(cè)ABCA1蛋白泛素化水平。結(jié)果顯示，IL-17A干預(yù)減少了ubiquitin與ABCA1蛋白的結(jié)合，聯(lián)合使用p38MAPK抑制劑較IL-17A作用的ubiquitin與ABCA1蛋白的結(jié)合增加(圖5)。以上結(jié)果提示，IL-17A主要是通過p38MAPK途徑調(diào)控ABCA1蛋白的泛素化降解過程，從而增加其表達(dá)。

3 討 論

隨著生活水平的不斷提高，由AS引發(fā)的心腦血管疾病逐漸成為威脅人們生命安全的主要疾病之一。在AS早期，其標(biāo)志性的病理特征是血管內(nèi)皮下大量巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積以及泡沫細(xì)胞的形成。而促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出及體內(nèi)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport, RCT)是機(jī)體抗AS機(jī)制的重要環(huán)節(jié)[9]?，F(xiàn)有資料已證明，ABCA1是RCT的重要組成部分，主要介導(dǎo)膽固醇從胞內(nèi)流出到貧脂的apoA-1并進(jìn)一步形成初生高密度脂蛋白，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流。因此，巨噬細(xì)胞上ABCA1蛋白的表達(dá)及活性對(duì)AS的發(fā)生、發(fā)展可以起到一定的抑制作用。

圖5 p38MAPK抑制劑可逆轉(zhuǎn)IL-17A對(duì)ABCA1蛋白泛素化降解的抑制作用

Fig.5 The role of p38MAPK in ubiquitination of ABCA1 protein induced by IL-17A in RAW264.7 macrophages

IL-17是一種主要由輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17, Th17)分泌的炎性細(xì)胞因子。目前，人們對(duì)IL-17在AS發(fā)生中的作用還存在較大爭(zhēng)議[10]。有資料表明，IL-17可以減輕AS斑塊的病變程度，具有一定的抗AS作用。ERBER[11]及CHENG[12]的研究證實(shí)，在apoE敲除小鼠中，IL-17A抗體可使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊變小。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，IL-17A可以增加巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)水平，而且這種作用并非是通過轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)達(dá)成。真核細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)水平的高低除了與合成過程有關(guān)，還受到其降解的影響。泛素-蛋白酶水解途徑是一種特異性降解蛋白的重要途徑，我們推測(cè)，IL-17A增加ABCA1蛋白的表達(dá)可能與其影響其泛素化降解過程有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在給予細(xì)胞CHX以抑制蛋白質(zhì)合成的情況下，IL-17A干預(yù)仍可增加細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)，表明IL-17A可抑制ABCA1蛋白的降解。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)IL-17A可以減輕ABCA1蛋白的泛素化程度。

p38MAPK通路可被環(huán)境中的多種理化刺激及氧化應(yīng)激、紫外線、缺氧缺血和IL-1等炎性細(xì)胞因子的刺激而活化。本研究結(jié)果表明，作為IL-17A的胞內(nèi)關(guān)鍵性信號(hào)分子，IL-17A干預(yù)在活化p38MAPK的同時(shí)，也提高了ABCA1蛋白的表達(dá)。與IL-17A單獨(dú)處理組相比，p38MAPK抑制劑SB203580降低了ABCA1蛋白的表達(dá)，說明IL-17A可以通過p38MAPK通路實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膽固醇代謝關(guān)鍵分子ABCA1的調(diào)控。p38MAPK抑制劑SB203580還可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞因IL-17A干預(yù)而降低的ABCA1泛素化水平，也進(jìn)一步證明IL-17A可通過p38MAPK途徑降低ABCA1的泛素化程度，使其降解減少，最終上調(diào)其表達(dá)。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-17A可以通過p38MAPK通路抑制ABCA1蛋白的泛素化降解過程，從而使巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)增高。這一作用及其機(jī)制的發(fā)現(xiàn)可在一定程度上解釋IL-17A的抗AS效用。