普洱茶通過降低NF-κB活性促巨噬細(xì)胞凋亡改善動(dòng)脈粥樣硬化

肖懿慧，賀 明，舒 娟，袁祖貽

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，陜西西安 710061)

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病[1]。在慢性炎癥和各種細(xì)胞因子作用下，循環(huán)單核細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮，然后遷移到內(nèi)膜下并轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，最后轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞[2]。同時(shí)，巨噬細(xì)胞分泌大量促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子，進(jìn)一步招募并激活巨噬細(xì)胞[3]。斑塊中巨噬細(xì)胞的數(shù)量和功能直接影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小和脂質(zhì)沉積[4]。以往的研究表明，巨噬細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中起著重要作用，而巨噬細(xì)胞凋亡可以減少粥樣硬化斑塊的形成，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[5-6]。

發(fā)酵茶具有調(diào)節(jié)血脂、抗炎、抗氧化等作用[7-9]。中國(guó)云南產(chǎn)的普洱茶是由云南大葉生綠等雜葉制成的后發(fā)酵(二次發(fā)酵)茶，飲用普洱茶可能有助于治療慢性炎癥性疾病。但是，目前沒有相關(guān)研究報(bào)道普洱茶的飲用是否對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有改善作用。本研究用載脂蛋白E缺陷(ApoE-/-)小鼠觀察飲用普洱茶對(duì)早期脂紋形成和晚期纖維脂肪斑塊進(jìn)展的影響，明確普洱茶是否發(fā)揮抗炎和調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞凋亡等作用。

1 材料與方法

1.1 材料ApoE-/-小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，共40只，雌雄各半。CD68抗體購(gòu)自英國(guó)Serotec公司；熒光素異硫氰酸結(jié)合山羊抗小鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Rockford Pierce公司；DAPI熒光染料購(gòu)自澳大利亞Molecular Probes公司；Trizol試劑購(gòu)自加拿大Invitrogen公司；RIPA裂解液購(gòu)自美國(guó)Cybrdi公司；蛋白酶抑制劑混合物購(gòu)自德國(guó)Roche Molecular Biochcal公司；抗p65及抗IκB抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；抗GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗鼠抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；IRDye 購(gòu)自美國(guó)LICOR公司；Nanodrop 1000購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；橙色染色劑購(gòu)自美國(guó)Licor公司；油紅O染色法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海歌凡生物公司；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒TMR RED購(gòu)自德國(guó)Roche公司；SYBR PrimescriptTMRT-PCR試劑盒購(gòu)自中國(guó)大連TaKaRa公司；轉(zhuǎn)移印跡系統(tǒng)iQ5TM、多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；BX51成像系統(tǒng)為日本Olympus公司；Image Pro Plus 6.0購(gòu)自美國(guó)MEDIA CYBERNETICS圖像技術(shù)公司；Odyssey紅外成像系統(tǒng)和Odyssey軟件來自美國(guó)Licor公司。

1.2 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立、干預(yù)及取材ApoE-/-小鼠在溫度可控的飼養(yǎng)設(shè)施中并模擬12 h明暗循環(huán)，自由進(jìn)食飲水；于6周齡時(shí)改為高脂飲食(含21%脂肪和0.15%膽固醇)，至18周齡，用于實(shí)驗(yàn)。

普洱茶提取物干預(yù)組小鼠以該提取物灌胃8周或16周(10 mL/d)，對(duì)照組小鼠灌胃ddH2O(10 mL/d)。麻醉小鼠后腹腔注射20 g/L阿維汀(0.25 mg/g)處死，穿刺左心室獲取血液，用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)灌注后，在顯微鏡下取出心臟和胸主動(dòng)脈。PBS腹腔灌洗后，收集巨噬細(xì)胞[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的《小鼠犧牲和組織收獲方案》。

1.3 普洱茶提取物的制備商品普洱茶樣品采集自中國(guó)云南省茶林，存放于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所[10]。普洱茶的加工過程[7]：將3 g普洱茶(云南慶豐香茶業(yè)有限公司)放在紗布袋中，然后浸入500 mL沸水中浸泡10 min；自然冷卻后，過濾除菌、分裝。中速定量濾紙除去固體物質(zhì)，0.22 μm孔徑過濾器過濾后，10 mL試管分裝。普洱茶中總多酚、總黃酮、游離氨基酸、茶黃素、茶紅素、茶褐色素等生化成分的含量見既往研究結(jié)果[11]。

1.4 脂質(zhì)斑塊檢測(cè)及CD68免疫組化檢測(cè)用油紅O染色法檢測(cè)胸主動(dòng)脈斑塊中的脂質(zhì)，并用偏光顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行分析。免疫組化方法檢測(cè)CD68：陰性對(duì)照與抗體稀釋液加入后均孵育過夜，然后將樣品與辣根過氧化物酶結(jié)合或熒光素異硫氰酸結(jié)合山羊抗小鼠二抗孵育1 h；DAPI染色細(xì)胞核。使用Olympus BX51成像系統(tǒng)對(duì)截面圖像進(jìn)行數(shù)字捕獲，并使用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行量化。

1.5 巨噬細(xì)胞的凋亡檢測(cè)40 g/L多聚甲醛固定組織，1 mL/L Triton X-100提高滲透性。樣品用PBS沖洗2次并干燥后將50 μL TUNEL反應(yīng)混合物添加到每個(gè)樣品中，按原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒TMR RED檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血管組織炎癥因子及巨噬細(xì)胞p65、IκB-β mRNA表達(dá)從小鼠的主動(dòng)脈組織或腹腔巨噬細(xì)胞中分離總RNA，用Trizol試劑提取RNA。使用Nanodrop1000定量總RNA。用SYBR PrimescriptTMRT-PCR試劑盒對(duì)得到的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR分析。95 ℃進(jìn)行5 s、63.5 ℃進(jìn)行20 s、72 ℃進(jìn)行10 s的3步PCR程序，持續(xù)45個(gè)周期。所有實(shí)時(shí)反應(yīng)均在iQ5TM多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行。內(nèi)參為GAPDH。

1.7 Western blot檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞中p65、IκB-β表達(dá)用RIPA裂解液提取腹膜巨噬細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，并將蛋白酶抑制劑混合物添加到所有樣品中。用100 g/L SDS-PAGE凝膠分離等量的蛋白質(zhì)提取物，轉(zhuǎn)移印跡系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用50 g/L脫脂乳于室溫緩慢搖動(dòng)1 h，阻斷非特異性結(jié)合。一抗(抗p65、抗IκB-β或抗GAPDH)4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h后洗膜，并在暗室顯影并定影。分析各個(gè)條帶的吸光度(A)值。

1.8 電泳遷移率變化分析(EMSA)使用細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑分離核蛋白。使用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(該系統(tǒng)檢測(cè)帶有寡核苷酸標(biāo)記的NF-κB)進(jìn)行EMSA分析。DNA結(jié)合反應(yīng)使用10 μg核提取物與寡核苷酸和凝膠移位結(jié)合緩沖劑。在室溫下暗盒中反應(yīng)30 min；加入2 mL橙色染色劑，并將樣品裝入預(yù)運(yùn)行的60 g/L聚丙烯酰胺凝膠中。用NF-κB p65抗體和未標(biāo)記的NF-κB寡核苷酸確定NF-κB DNA結(jié)合活性的超移和特異性。對(duì)凝膠進(jìn)行掃描，并使用Odyssey紅外成像系統(tǒng)和Odyssey軟件對(duì)信號(hào)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 普洱茶干預(yù)ApoE-/-小鼠降低脂質(zhì)斑塊面積和脂質(zhì)成分與對(duì)照組相比，普洱茶提取物干預(yù)ApoE-/-小鼠8周組的主動(dòng)脈根部脂質(zhì)斑塊面積分?jǐn)?shù)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)16周組脂質(zhì)斑塊面積分?jǐn)?shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；此外，普洱茶提取物干預(yù)8周組的油紅O陽性區(qū)域平均比值也較對(duì)照組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；16周干預(yù)組則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 油紅O染色檢測(cè)普洱茶提取物干預(yù)ApoE-/-小鼠對(duì)主動(dòng)脈根部脂質(zhì)斑塊面積的影響Fig.1 Pu-erh tea extract inhibited atherosclerosis detected by oil red stainingA～D:油紅O染色結(jié)果(×200)。A、B:普洱茶提取物分別處理8周、16周;C、D:ddH2O分別處理8周、16周;E:脂質(zhì)斑塊面積分?jǐn)?shù)的量化分析(n=6);F:油紅O染色法檢測(cè)斑塊的量化分析(n=6)。與對(duì)照組(ddH2O組)比較,*P<0.05。

2.2 普洱茶提取物促進(jìn)ApoE-/-小鼠斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡與對(duì)照組相比，普洱茶提取物干預(yù)8周組斑塊內(nèi)CD68陽性率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(6.9±1.1)%vs. (4.2±1.0)%，P<0.05]；干預(yù)16周組CD68陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(14.1±2.1)%vs. (8.2±2.0)%，P<0.01]。此外，與對(duì)照組相比，普洱茶提取物干預(yù)8周和16周的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊中巨噬細(xì)胞平均比例分別降低41.3%(P<0.05)和45.2%(P<0.05)。與對(duì)照組相比，普洱茶提取物干預(yù)8周組的斑塊中凋亡巨噬細(xì)胞與總巨噬細(xì)胞的平均比率增加[(37.4±5.4)%vs. (8.5±2.8)%，P<0.01]；普洱茶提取物干預(yù)16周的平均比率增加[(46.2±5.8)%vs. (17.1±4.4)%，P<0.05，圖2]。

圖2 免疫熒光染色檢測(cè)普洱茶提取物促進(jìn)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞凋亡Fig.2 Pu-erh tea extract promoted the apoptosis of macro-phages in the plaqueA～D:免疫熒光染色結(jié)果(×200)。A、B:普洱茶提取物分別處理8周、16周;C、D:ddH2O分別處理8周、16周;E:CD68陽性率量化分析(n=6);F:巨噬細(xì)胞凋亡率量化分析(n=6)。與對(duì)照組(ddH2O組)比較,*P<0.05。

2.3 普洱茶提取物干預(yù)降低NF-κB的表達(dá)并抑制其DNA結(jié)合活性Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，普洱茶提取物干預(yù)8周和16周組ApoE-/-小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞中p65蛋白表達(dá)分別降低40.8%(P<0.05)和61.8%(P<0.01)。干預(yù)8周組IκB-β蛋白表達(dá)略有下降(P>0.05)，干預(yù)16周組IκB-β表達(dá)明顯下降[(52.3±8.2)%，P<0.05，圖3A～圖3C]。

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中的p65 mRNA表達(dá)分別下降(28.1±9.1)%(P<0.05)和(53.6±6.4)%(P<0.05)，IκB-β的mRNA表達(dá)均下降，干預(yù)16周組下降更為明顯[(56.1±4.9)%,P<0.05，圖3D、圖3E]。

圖3 普洱茶提取物干預(yù)對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)P65、IκB-β蛋白及mRNA表達(dá)的影響

Fig.3 Effects of pu-erh tea extract intervention on protein nd and mRNA expressions of P65 and IκB-β in macrophages

A～C：Western blot檢測(cè)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；D、E：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。n=6。與對(duì)照組(ddH2O組)比較，*P<0.05，**P<0.01。

EMSA法測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞核蛋白中NF-κB的DNA結(jié)合活性，干預(yù)8周組及16周組其結(jié)合活性平均灰度值分別降低(49.4±7.7)%(P<0.05)和(75.6±10.1)%(P<0.01，圖4)。

2.4 普洱茶提取物降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果(圖5)顯示，普洱茶提取物干預(yù)16周組ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈組織IL-6、IL-12和TNFα mRNA表達(dá)分別比對(duì)照組下降(17.83±10.8)% 、(36.39±12.2)%和(43.73±14.8)%(P<0.05)；而對(duì)血管組織中IL-8、IL-18、MMP9、ICAM和VCAM的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)。

圖4 EMSA分析巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB DNA結(jié)合活性變化(A)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(B)

Fig.4 Effect of pu-erh tea extract intervention on NF-κB

與對(duì)照組(ddH2O組)比較，*P<0.05，**P<0.01(n=6)。

3 討 論

巨噬細(xì)胞由血液循環(huán)中的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，吞噬氧化型低密度脂蛋白后轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞[5-6]。巨噬細(xì)胞促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中最主要的炎性細(xì)胞，巨噬細(xì)胞凋亡可抑制斑塊的進(jìn)展和促進(jìn)斑塊修復(fù)，巨噬細(xì)胞可能是動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防與治療的重要靶細(xì)胞[5-6]。

發(fā)酵茶被證實(shí)具有調(diào)節(jié)血脂、抗炎、抗氧化的作用[7-9]。既往研究均觀察到發(fā)酵茶中提取某一種成分對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響[10-12]，但在動(dòng)物或人類中，尚沒有研究觀察飲用普洱茶對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響，對(duì)巨噬細(xì)胞功能及凋亡的研究更是未見報(bào)道。本研究表明，普洱茶提取物喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠16周明顯減少主動(dòng)脈粥樣斑塊面積和脂質(zhì)沉積，同時(shí)觀察到普洱茶提取物明確促進(jìn)斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡，這提示飲用普洱茶可能通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成。

圖5 普洱茶提取物對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

Fig.5 Effect of pu-erh tea extract on the expression of cytokine mRNA in ApoE-/-mice aortic tissue

A～H：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對(duì)照組(ddH2O組)比較，*P<0.05。

有研究發(fā)現(xiàn)，激活NF-κB能夠抑制巨噬細(xì)胞凋亡[13]。本研究中，普洱茶提取物喂養(yǎng)小鼠8周及16周，主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊內(nèi)及巨噬細(xì)胞中NF-κB亞單位p65 蛋白表達(dá)及mRNA活性均明顯降低；巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB DNA結(jié)合活性明顯降低，提示飲用普洱茶可能通過抑制NF-κB表達(dá)及活性，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡。IκB 是NF-κB 的抑制因子，本研究發(fā)現(xiàn)，短期普洱茶提取物喂養(yǎng)(8周)，IκBβ mRNA及蛋白表達(dá)變化不明顯，長(zhǎng)期喂養(yǎng)(16周)則其mRNA及蛋白表達(dá)均下降明顯，提示飲用普洱茶對(duì)NF-κB表達(dá)及活性的抑制作用并未通過IκBβ介導(dǎo)。

動(dòng)脈粥樣硬化的本質(zhì)是動(dòng)脈慢性炎癥[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，普洱茶提取物喂養(yǎng)干預(yù)16周后，ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中TNFα、IL-6及IL-12 mRNA表達(dá)明顯下降。提示飲用普洱茶降低體內(nèi)炎癥因子水平，進(jìn)而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展起到抑制作用。

綜上可以得出結(jié)論：飲用普洱茶可能通過抑制NF-κB表達(dá)及活性，促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低體內(nèi)炎癥因子水平，進(jìn)而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。此機(jī)制可能并未通過IκB介導(dǎo)，確切機(jī)制還需要在更多的動(dòng)物模型和人群中進(jìn)一步研究。