芽孢桿菌BS-6基于全基因組數(shù)據(jù)的分類鑒定及拮抗能力分析

戚家明 孫杉杉 張東旭 徐志文 徐延平

（1. 河北省農業(yè)生物技術工程技術研究中心，秦皇島 066004；2. 河北省農業(yè)廳植物營養(yǎng)與海洋功能肥料重點實驗室，秦皇島 066004；3. 領先生物農業(yè)股份有限公司，秦皇島 066004；4. 秦皇島領先康地農業(yè)技術有限公司，秦皇島 066400）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是芽孢桿菌屬中的一種好氧革蘭氏陽性菌［1］。枯草芽孢桿菌是一種廣泛分布植物根際的有益微生物，能夠產生很多抗菌譜廣的具有抗菌活性的物質防治植物病害，具有良好的病害防治能力［2］。又因為枯草芽孢桿菌可以產生繁殖能力和抗逆性極強的芽孢休眠體，所以越來越多的枯草芽孢桿菌菌株被開發(fā)為微生物菌劑廣泛應用于農業(yè)生產中。

枯草芽孢桿菌擁有著廣泛的抑菌譜，具有較強的抑制病原菌生長的能力，其主要原因在于它可以分泌多種拮抗類物質，其中有通過非核糖體合成的低分子抗菌肽以及通過核糖體合成的大分子蛋白類細菌素［3］，通過非核糖體途徑合成的細菌素包括低分子量的伊枯草菌素（Iturin）、抗菌肽表面活性素（Surfactin）、芬枯草菌素（Fengycin）、溶桿菌素（Bacilysin）、Bacillaene、Rhizocticin 和 Mycobacillin等；通過核糖體途徑合成的細菌素包括 Subtilin、Mersacidin、Ericin、Sublancin 和 Subtilosin A 等［4-5］。

隨著近現(xiàn)代測序技術的進步，尤其二代測序（Next generation sequencing，NGS）技術的出現(xiàn)以及測序成本的下降，為研究枯草芽孢桿菌提供了新的方法。利用全基因組序列信息對枯草芽孢桿菌近緣種群進行分類鑒定和抗性潛力快速挖掘具有快捷和準確性高等優(yōu)點?？莶菅挎邨U菌類群間的親緣關系較近，16S rRNA序列相似度太高從而導致區(qū)分度較低［6］，為了解決16S rRNA區(qū)分度低的問題，有研究在細菌的基因組中挑選了如gyrA［6］、rpoB［7］及gyrB［8］等在系統(tǒng)進化過程中保守但又具有相對較快的變異速率的基因作為補充。相比于單一基因分析，基于基因組水平的平均核苷酸一致性（Average nucleotide identity，ANI）［9-11］分析和 DNA 同源性（DNA-DNA hybridization，DDH）［12］分析對于枯草近緣種群具有更高的區(qū)分度。在挖掘次級抗菌代謝產物方面，antiSMASH在線工具自發(fā)布以來，在挖掘次級代謝產物基因簇領域得到了廣泛的應用，成為了應用最廣泛的挖掘次級代謝產物合成基因簇的應用工具［13］。

本試驗對從土壤中分離到的一株具有良好生防效果的芽孢桿菌BS-6進行研究，通過拮抗試驗發(fā)現(xiàn)BS-6對病原真菌的生長具有良好的抑制效果，通過全基因組測序得到BS-6的全基因組信息，結合16S rRNA序列、gyrA基因序列、平均核苷酸一致性（ANI）及DNA 同源性（DDH）綜合分析可以對芽孢桿菌BS-6的分類地位進行準確鑒定，利用antiSMASH在線工具對BS-6的抑菌相關功能基因進行分析探索其拮抗特性，為芽孢桿菌BS-6的農業(yè)生產應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：芽孢桿菌菌株BS-6，該菌株為土壤中篩選到具有較好生防效果的根際微生物，由領先生物農業(yè)股份有限公司分離并保存。

植物病原真菌：馬鈴薯枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和蘋果輪紋病菌（Botryospuaeria berengerianade Not.），由領先生物農業(yè)股份有限公司分離并保存。

主要培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基，蛋白胨 10.0 g/L、酵母粉 5.0 g/L、氯化鈉 10.0 g/L，pH=7；PDA培養(yǎng)基，馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L。

1.2 方法

1.2.1 植物病原真菌拮抗試驗 采用平板對峙法，首先在平皿中間分別放置馬鈴薯枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和蘋果輪紋病菌（Botryospuaeria berengerianade Not.）等3種植物病原菌的菌絲塊。然后在菌絲塊四周滴加10 μL BS-6的菌懸液，每種病原菌重復3次拮抗試驗，設不接種BS-6的空白對照，于培養(yǎng)箱中20℃培養(yǎng)5 d。根據(jù)下列公式計算BS-6對植物病原菌的生長抑制率：

1.2.2 芽孢桿菌BS-6的全基因組測序 將BS-6接于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期，在4℃下4 500 r/min離心10 min，舍去上清液收集菌體，利用液氮冷凍保存送至北京諾禾致源科技股份有限公司（Beijing Novogene Bioinformatics Technology Co.，Ltd）進行全基因組測序，獲得其全基因組序列，將BS-6的全基因組信息上傳至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），獲得登錄號為SSXZ00000000。

1.2.3 16S rRNA 及gyrA基因序列分析 根據(jù)全基因組注釋信息，選擇16S rRNA和gyrA基因序列分別提交至ezbiocloud.net數(shù)據(jù)庫及NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對分析，利用MEGA 7.0.26軟件Neighbor-Joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 ANI 和 DDH 分析 使用 Jspecies（http：//jspecies.ribohost.com/jspeciesws//） 中 的 Mummer［14］對研究中的菌株全基因組進行平均核苷酸一致性（Average nucleotide identity，ANI）值的計算。使用Genome-to-Genome Distance Calculation（http：//ggdc.dsmz.de/distcalc2.php）［15］對研究中的菌株全基因組進行DDH值的計算

1.2.5 次級代謝產物合成基因簇分析 本研究利用antiSMASH 3.0［16］bacterial version（https：//antismash.secondarymetabolites.org/）對BS-6菌株中次生代謝物合成基因組簇進行預測。

2 結果

2.1 植物病原真菌拮抗試驗

拮抗試驗結果如圖1所示，BS-6對馬鈴薯枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、玉米紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和蘋果輪紋病菌（Botryospuaeria berengerianade Not.）的生長均具有良好抑制效果，抑菌率分別為80.00%、68.79%和76.19%。其中BS-6對馬鈴薯枯萎病的病原微生物尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）具有顯著的抑菌效果。

圖1 BS-6對馬鈴薯枯萎病菌（A）、蘋果輪紋病菌（B）和玉米紋枯病菌（C）的抑制效果

2.2 菌株BS-6的分子生物學鑒定

2.2.1 基于16S rRNA 序列比對結果的系統(tǒng)進化分析 經全基因組測序，獲得芽孢桿菌BS-6基因組草圖，上傳至NCBI獲得登錄號為SSXZ00000000，基因組大小為3.99 Mb，GC含量為43.84%。將全基因組中注釋到的16S rRNA序列提交至ezbicloud和NCBI的數(shù)據(jù)庫中進行比對，選取部分同源性高于99%的菌株序列利用MEGA7軟件的鄰位連接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹（相似度重復計算1 000次）。芽孢桿菌BS-6基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。根據(jù)比對結果與菌株BS-6同源性高于99%的菌株均為芽孢桿菌屬，系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示BS-6與模式菌株Bacillus halotoleransATCC 25096聚為一類，但bootstrap 支持值較低，可以確定BS-6為芽孢桿菌屬，無法準確鑒定BS-6到種。

2.2.2 基于gyrA基因序列 BLAST 結果的系統(tǒng)進化分析 將測序得到的gyrA基因序列提交至NCBI進行BLAST分析，選取2株同源性較高的序列，同時根據(jù)16S rRNA比對結果選取其中具有gyrA基因序列信息的菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，BS-6與Bacillus subtilissubsp.spizizeniiW23聚為一類。

2.2.3 ANI 和 DDH 分析 選擇在16S rRNA 序列和gyrA基因序列比對中的具有全基因組序列數(shù)據(jù)的模式菌株與BS-6進行ANI及DDH分析，該9株芽孢菌的ANI值及DDH值結果如表1所示。

其中BS-6與模式菌株Bacillus subtilissubsp.spizizeniiTU-B-10的ANI值為96.72%，高于網站給出的95%的種間鑒定標準。BS-6與模式菌株Bacillus subtilissubsp.spizizeniiTU-B-10的DDH值為71.70%高于網站給出的70%的種間鑒定標準。

2.2.4Bacillus subtilisBS-6次級代謝產物合成基因簇分析 將Bacillus subtilisBS-6的全基因組序列上傳至在線軟件antiSMASH中進行次級代謝產物合成基因簇分析，共發(fā)現(xiàn)有11個與次級代謝產物合成相關的基因簇。同時對2.2.3中參與分類的芽孢菌株進行次級代謝產物合成基因簇分析，對基因組中已知功能的基因簇進行統(tǒng)計，統(tǒng)計結果如表2所示。

圖2 基于16S rRNA序列比對結果構建的菌株BS-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于gyrA序列比對結果構建的菌株BS-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 BS-6及其近緣菌種平均核苷酸一致性（ANI）和DNA同源性分析（DDH）數(shù)值

Bacillus subtilisBS-6與親緣關系較近的Bacillus subtilissubsp.spizizeniiTU-B-10具有類似的次級代謝產物合成基因簇組成，Bacillus subtilisBS-6中具有7個次級代謝產物合成基因簇，且均具有抗菌作用，其中Mycosubtilin和Rhizocticin為Bacillus subtilisBS-6及其親緣種特有的次級抗菌代謝產物合成基因簇。

表2 BS-6及其近緣菌種基因組中已知功能的基因簇數(shù)量統(tǒng)計

3 討論

植物病害一直以來都是影響糧食產量的重要因素，傳統(tǒng)的化學農藥防治對病害控制具有速效性，但隨著化學農藥的大量使用，病原微生物的耐藥性和農藥殘留產生的“副作用”也日益嚴重。近年來綠色高效的生物防治作為防治植物病害的重要措施逐漸受到人類的重視。其中芽孢桿菌特別是枯草芽孢桿菌作為生物防治的代表菌株具有良好的生防效果，被廣泛的應用在農業(yè)生產中。

本團隊從植物連作根際土壤中分離到了一株芽孢桿菌BS-6，前期溶血試驗表明其溶血活性微弱，具有較高的安全性，經過應用試驗和拮抗試驗發(fā)現(xiàn)其具有良好的應用效果，本試驗通過全基因組測序得到了BS-6的基因組序列，結合相關軟件分析確定了BS-6的分類地位及其抗病防病能力的分析。

16S rRNA基因是細菌系統(tǒng)發(fā)育和種屬鑒定的常用分類工具［17］，但是枯草芽孢桿菌類群間的親緣關系較近，導致16S rRNA序列區(qū)分度降低無法準確區(qū)分近緣種群［18］，在本研究中利用BS-6的16S rRNA基因序列無法將其與其他芽孢桿菌進行準確區(qū)分，為了準確鑒定BS-6的分類地位，首先挑選了gyrA基因作為分類工具，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)BS-6與枯草芽孢桿菌聚為一類。又對BS-6及其親緣種的平均核苷酸一致性（ANI）及DNA同源性（DDH）進行了分析，可以準確將BS-6鑒定為枯草芽孢桿菌?；诨蚪M水平的ANI和DDH分析驗證了gyrA基因分析的結果，這表明gyrA基因作為枯草芽孢桿菌近緣種的分類工具具有良好的區(qū)分度。

antiSMASH是一種能夠較完整的預測細菌和真菌次生代謝產物基因簇的在線生物信息學工具，特別是與生物抗生素合成有關的基因簇。本研究將與BS-6親緣關系較近的幾株芽孢桿菌的基因組提交至antiSMASH，對這幾株親緣關系較近的芽孢菌中的次生代謝產物基因簇進行分析，對比其在抑菌抗病方面的潛力大小。BS-6具有最多的7種生物抗生素合成有關的基因簇?？莶菅挎邨U菌產生抗菌肽的途徑主要包括核糖體途徑和非核糖體2條途徑。BS-6中的抗菌肽核糖體途徑合成的抗菌肽主要有：常見的羊毛硫細菌素Subtilin；稀有的羊毛硫細菌素類有Subtilosin A 等；非核糖體途徑合成的抗菌物質主要有 Surfactin、Mycosubtillin、Rhizocticin和Bacillibactin 等［4-5］。

Subtilin是一類含有帶正電荷的A類羊毛硫細菌素，對于革蘭氏陽性菌具有很強的抑制活性［19-21］；Subtilosin A是一種抑菌譜非常廣的抑菌肽，對單核細胞增生李斯特菌、肺炎克氏桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用［22-23］。

Surfactin是許多芽孢桿菌中都存在的廣譜抗菌物質，同時也是一種很強的表面活性劑［24-25］，具有雙重身份的 Surfactin 具有乳化、發(fā)泡［26］，抗病毒［27］、抗支原體、抗致病真菌、抗李斯特菌和殺幼蟲的作用［28-30］。Bacillibactin是一種枯草芽孢桿菌分泌出來的對鐵離子具有高親和性的螯合劑，可以競爭性結合環(huán)境中對于病原菌生長和發(fā)揮活性必須的可溶性鐵離子［31］。Bacillaene是由芽孢桿菌分泌的一種多聚烯類抗生素抑菌物質，主要抑制原核生物蛋白質的合成［32-33］。

相比于其它近緣種，抗菌物質Mycosubtillin和Rhizocticin的合成基因簇是BS-6基因組中特有的，據(jù)文獻報道該兩種物質均具有較強的抑制真菌活性［34-36］。其中 Mycosubtillin對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、白色念珠菌（Candida albicans）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和熱帶念珠菌（Candida tropicalis）具有抑菌活性［34，37-38］。

拮抗試驗結果發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BS-6對于真菌具有較強的抑制作用，尤其對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的抑制效果最為顯著，說明BS-6在防治由尖孢鐮刀菌引發(fā)的植物病害時可能具有良好的效果，具有較大的應用潛力。

除以上7種芽孢桿菌屬重要或特有的次生代謝產物基因簇外，BS-6中還存在4種功能未知的基因 簇， 其 中CDPS（tRNA-dependent cyclodipeptide synthases）類1種，T3PKS（Type III PKS）類1種，萜類（Terpene）2種，這表明BS-6中可能存在具有合成新的抑菌物質的基因簇，BS-6具有較大的農業(yè)應用潛力。

4 結論

本研究通過全基因組測序得到了芽孢桿菌BS-6的基因組序列，通過對BS-6的16S rRNA基因、gyrA基因、平均核苷酸一致性及DNA 同源性分析可以準確將BS-6鑒定為枯草芽孢桿菌。通過antiSMASH在線工具對BS-6中次生代謝產物基因簇進行分析，共發(fā)現(xiàn)11個相關基因簇，其中7種為芽孢桿菌屬重要或特有的次生代謝產物基因簇，具有較強的抑制病原微生物生長的功能。本研究通過基因組分析發(fā)現(xiàn)菌株BS-6具有較強的應用潛力，為其在生物防治及大田作物抗病和增產方面的應用方面提供了理論依據(jù)。