外源硫與乙烯緩解馬齒莧鎘脅迫的生理機(jī)制研究

王竹承 劉輝 李榮華 陳新 李欣 路致遠(yuǎn)

（1. 滄州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，滄州 061001；2. 貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴陽 550003）

鎘（Cadmium，Cd）的生物半衰期長，即使是低濃度Cd，對人體也會(huì)造成潛在的威脅，我國農(nóng)業(yè)土壤Cd位點(diǎn)超標(biāo)率達(dá)7%，Cd已成為我國土壤重金屬污染中的首要污染物［1］。Cd脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量上升，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)、抑制碳固定酶活性，并通過影響蛋白酶活性而導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂等［2-3］。另外，抑制營養(yǎng)元素吸收而導(dǎo)致植株生長受限［4］，同時(shí)還能通過食物鏈危害人體健康［5］。因此，研究緩解或解除植物中Cd毒害的措施及其機(jī)理，是當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題。

S是植物體內(nèi)合成半胱氨酸（Cysteine，Cys）、甲硫氨酸（Methionine，Met）、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、 植 物 螯 合 素（Phytochelins，PCs）、金屬硫蛋白（Metallothioneins，MTs）等硫代謝物的基本元素，而這些物質(zhì)對提升植物Cd耐受起著關(guān)鍵作用［6］。研究表明，Cys可通過其自身的抗氧化特性調(diào)節(jié)植物體內(nèi)氧化還原水平以緩解鹽脅迫誘導(dǎo)的大麥生長抑制［7］。充分的硫肥可保證充足的GSH供應(yīng)，以緩解因鹽脅迫誘導(dǎo)的氧化脅迫對植物光合效率和生長的影響［8］。同時(shí)，植物對S的吸收和同化可促進(jìn)蛋白源和非蛋白源硫醇的合成，從而提升植物對Cd的耐受性［9］。添加外源S可以提升Cd脅迫下植物體內(nèi)GSH的合成，降低ROS的積累，減少ROS對植物葉片基質(zhì)蛋白和類囊體蛋白的攻擊，調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)，從而增強(qiáng)植物的光合能力［6］；提升PCs、MTs的合成，并與Cd結(jié)合形成螯合物，降低Cd 毒性［10-11］。

乙烯是一種氣態(tài)植物激素，在逆境脅迫下調(diào)控植物的光合作用與生長具有重要作用［12］。乙烯與S代謝互作可促進(jìn)植物對各種非生物逆境脅迫的耐受性。如添加外源GSH可促進(jìn)擬南芥體內(nèi)乙烯的合成，以提升植物砷耐受能力［13］；乙烯處理可顯著提升植物體內(nèi)GSH含量，以應(yīng)對鹽脅迫［14］；乙烯與N或S互作，可以促進(jìn)鹽脅迫下油菜的光合作用［15］。因此，乙烯信號(hào)途徑在調(diào)節(jié)植物逆境脅迫下的光合作用具有重要作用。馬齒莧是一種具有清熱利濕、解毒消腫、消炎、止渴、利尿作用的藥用材料，嫩莖葉可作蔬菜食用或者飼料加工，營養(yǎng)價(jià)值較高。馬齒莧對Cd具有一定的吸附和耐受能力［16］，但對其中的機(jī)理尚待研究。

本研究以野生馬齒莧為試材，探討Cd脅迫下外源S與乙烯對馬齒莧光合作用、氧化還原水平、內(nèi)源S含量、葡萄糖含量等的影響，同時(shí)，施用乙烯活性抑制劑NBD，以揭示乙烯信號(hào)途徑在S誘導(dǎo)植物Cd耐受過程中的作用機(jī)制，從而為乙烯和硫作為潛在的農(nóng)業(yè)土壤Cd污染矯正劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬齒莧種子購自江蘇長景種業(yè)有限公司（荷蘭進(jìn)口）。將馬齒莧種子于35℃水浴浸種處理12 h，播于裝有沙子的育苗盒中，置于人工氣候培養(yǎng)箱（LRH-800-GS，天津市福元銘儀器設(shè)備有限公司）中栽種。培養(yǎng)箱條件：14 h白天/10 h黑夜，晝夜溫度為30℃/25℃，相對濕度75%，光強(qiáng)設(shè)置為500 μmol/（m2·s）。前期每天用自來水澆水一次，生長1周后改用1/2 Hoagland營養(yǎng)液的營養(yǎng)液（pH6.0）澆水，澆水量以使沙子充分濕潤為準(zhǔn)。待馬齒莧幼苗長至10 cm左右時(shí)，選擇長勢良好和長勢一致的植株進(jìn)行試驗(yàn)處理。

試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理（表1）。每個(gè)處理8盆，每盆種植15株。脅迫處理15 d后進(jìn)行指標(biāo)參數(shù)測定，每個(gè)指標(biāo)測定生物學(xué)重復(fù)3次，取平均值。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 方法

1.2.1 Cd含量測定 收集脅迫處理后的馬齒莧葉片與根，稱取鮮重，測量長度后，110℃殺青1h、70℃恒溫干燥、稱重。干樣用HNO3-HClO4（4∶1 V/V）消煮（160℃）至澄清，定容以后，利用原子吸收分光光度計(jì)測定各組織中的Cd含量。

1.2.2 H2O2與組織硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）含量測定 根據(jù)Okuda等［17］方法進(jìn)行H2O2提取與含量測定。參考張志良等［18］方法測定MDA含量。

1.2.3 ATP硫酸化酶（ATP-S）、谷胱甘肽還原酶（GR）活性以及S含量測定 稱取1.0 g新鮮馬齒莧葉片于預(yù)冷的研缽中，加入4倍體積預(yù)冷的提取液（10 mmol/L Na2EDTA、20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、2 mmol/L DTT和0.01 g/mL PVP），于冰上研磨至勻漿，4℃、13 400 r/min離心10 min。取上清液，參照Khan等［19］方法測定ATP-S和GR活性。

葉片S含量測定：稱取鮮重，殺青、干燥、稱重。干樣用 HNO3-60%HClO4（85∶1，V/V）消煮（160℃）至澄清，定容以后，利用原子吸收分光光度計(jì)測定S含量。

1.2.4 半胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量測定

Cys含量測定：參考Giatonde［20］方法。

Met含量測定：稱取0.5 g新鮮馬齒莧葉片浸于20 mL 6.0g/L的HCl溶液中，20-24 h以后加入1.0 g的活性炭，水浴蒸發(fā)得濃縮液，并過濾。向?yàn)V液中依次添加0.1 mL硝普鈉、2.0 mL的3%甘氨酸溶液、4.0mL去離子水和2.0 mL 5 g/L NaOH。再添加4.0 mL磷酸溶液，混勻，并于450 nm處讀取吸光值，并計(jì)算 Met含量［21］。

GSH與GSSG含量測定：稱取0.5 g馬齒莧新鮮葉片于預(yù)冷的研缽中，加入10 mL 5%磺基水楊酸，然后研磨成勻漿，4℃、9 500 r/min離心10 min。量取2.0 mL上清液于離心管中，加入2.4 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH7.0）和160 μL 2-硫代硝基苯甲酸（5，5'-Dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）?；靹?，室溫靜置2 min后，在412 nm處測定其吸光值，得GSH含量。GSSG含量則在上述反應(yīng)液中添加100 μL 2-乙烯吡啶，相同條件測得吸光值，得GSSG含量。GSH與GSSG含量的比值即為氧化還原水平［22］。

1.2.5 葡萄糖含量測定 參照Krishnaveni等［23］方法測定葡萄糖的含量。

1.2.6 氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶（ACS）活性、乙烯含量測定 利用植物氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶（ACC）ELISA試劑盒（購自蘇州江萊酶聯(lián)免疫研究所）、IL8910植物乙烯（Ethylene）含量比色法定量檢測試劑盒（購自上海真奧生物科技有限公司）分別測定馬齒莧葉片中氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶（ACS）活性和乙烯含量，操作步驟詳見對應(yīng)的說明書。

1.2.7 光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度、蒸騰速率、Rubisco酶活性測定 利用LI-6400XT便攜式光合測定儀測定不同處理下馬齒莧葉片的光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度，使用人工光源，光強(qiáng)為 1 000 μmol/（m2·s）。

Rubisco酶活性測定：稱取1.0 g新鮮葉片于4℃預(yù)冷的研缽中，加入10 mL預(yù)冷的提取液（0.25mol/L Tris-HCl（pH 7.8）、0.05 mol/L MgCl2、0.0025 mol/L EDTA 和 1% Dithiothreitol（DTT）），研磨至勻漿。4℃、9 500 r/min離心10 min，上清液即為含有Rubisco酶的粗提液。參考Usuda［24］的方法測定粗提液中Rubisco酶活性。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示。采用SPSS 18.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各處理間數(shù)據(jù)采用方差分析（One way ANOVA），利用最小顯著差（LSD）法檢驗(yàn)差異顯著性（P≤0.05），采用Microsoft Excel 2007作圖。

2 結(jié)果

2.1 乙烯和S對馬齒莧Cd吸收的影響

Cd脅迫處理以后，馬齒莧葉片與根中的Cd含量迅速上升，添加外源S（T2）或乙烯（T3）可使根Cd含量分別下降40.89%和35.52%，而S+乙烯處理（T4），則可使根Cd含量降低52.53%；添加外源S（T2）和乙烯（T3）可使馬齒莧葉片Cd含量分別下降38.99%和31.99%，S+乙烯處理則使葉片Cd含量下降52.75%（圖1）。結(jié)果表明，外源S和乙烯對降低馬齒莧植株中的Cd含量具有協(xié)同效應(yīng)。

2.2 乙烯和S對Cd脅迫下馬齒莧氧化脅迫的影響

由表2可知，Cd脅迫可使馬齒莧葉片的H2O2和MDA含量迅速上升，而添加外源S（T2）或者乙烯（T3）均可使馬齒莧葉片中的H2O2含量相對Cd處理降低約40%，MDA含量則均下降約35%，當(dāng)共同添加S和乙烯（T4）時(shí)，可使H2O2與MDA含量均降低約50%。結(jié)果表明，外源S和乙烯均可通過降低H2O2含量，減輕Cd脅迫導(dǎo)致馬齒莧的膜脂質(zhì)過氧化程度，且共同添加時(shí)，兩者對解Cd毒具有協(xié)同效應(yīng)。

圖1 外源S和乙烯對Cd脅迫處理后馬齒莧葉片與根Cd含量的影響（nd=no data）

2.3 外源硫和乙烯對馬齒莧葉片硫代謝的影響

在Cd脅迫后，馬齒莧葉片ATP-S、GR酶活性比對照分別上升了42.38%和15.40%，而S含量則下降了19.18%；Cd脅迫下，添加外源S（T2）則可使ATP-S、GR酶活性和S含量比對照分別提升2.07、1.64和1.16倍；添加外源乙烯（T3）則比對照分別提升2.09、1.66和1.14倍；同時(shí)添加S和乙烯（T4）則比對照分別提升2.83、2.20和1.22倍（表2）。

Cd脅迫可顯著提高馬齒莧葉片Cys和Met含量，外源S（T2）或乙烯（T3）對Cys和Met含量的影響相近，可使其含量比對照分別提高約1.4倍和2.1倍，而同時(shí)添加S和乙烯（T4），則分別提高2.22倍和2.72倍（圖2-A和圖2-B）。

表2 外源S和乙烯對Cd脅迫下馬齒莧葉片MDA含量、H2O2含量、ATP-S活性、GR活性、硫含量的影響

Cd脅迫處理（T1）與對照（CK）相比，可提升馬齒莧葉片GSH含量約26.67%，外源S（T2）或者乙烯（T3）均可使GSH含量比對照增加約80%，同時(shí)添加S和乙烯（T4）則增加約1.2倍（圖2-C）。

逆境脅迫條件下，GSH與GSSG的比值表示為植株的氧化還原水平（Redox state）。結(jié)果顯示，Cd脅迫下馬齒莧葉片的氧化還原水平與對照相比下降約3倍，添加外源S（T2）和乙烯（T3）對馬齒莧葉片氧化還原水平的影響效果相近，均為Cd處理（T1）的3.9倍，而同時(shí)添加S和乙烯后的馬齒莧葉片氧化還原水平是Cd處理的4.55倍（圖2-D）。

2.4 ACS活性與乙烯含量的變化

Cd脅迫下，馬齒莧葉片ACS活性和乙烯含量與對照相比顯著升高，其中ACS活性提升1.21倍，乙烯含量則提升1.43倍。添加外源S（T2）或者乙烯（T3），ACS活性較Cd處理均上升約16%，乙烯產(chǎn)量則均上升約20%。同時(shí)添加外源S和乙烯（T4），則可使ACS活性與乙烯產(chǎn)量分別上升51.84%和85.74%（圖 3）。

2.5 葡萄糖含量變化

與對照相比，Cd脅迫（T1）可提升馬齒莧葉片中葡萄糖含量約67.52%，外源S（T2）或乙烯（T3）可使葡萄糖含量比Cd處理（T1）分別降低20.99%和18.07%，同時(shí)添加S和乙烯（T4）則可使葡萄糖含量下降26.45%（圖4）。

2.6 光合作用及其相關(guān)酶活性變化

與對照相比，Cd脅迫處理可導(dǎo)致凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度、Rubisco酶活性與對照相比顯著降低。在Cd脅迫環(huán)境中，添加外源S或乙烯，均可使馬齒莧葉片光合作用參數(shù)與Rubisco酶活性顯著增加，且提升效果一致。同時(shí)添加S和乙烯（T4）可使凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度、Rubisco酶活性分別增加47.24%、33.61%、27.09%和87.76%（表3）。

圖2 外源S和乙烯對Cd脅迫下馬齒莧葉片中Cys（A）、Met（B）、GSH（C）、氧化還原水平（D）的影響

圖3 外源S和乙烯對Cd脅迫馬齒莧葉片ACS活性（A）與乙烯產(chǎn)量（B）的影響

圖4 外源S和乙烯對Cd脅迫下馬齒莧葉片葡萄糖含量的影響

表3 外源S和乙烯對Cd脅迫下馬齒莧葉片光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度、Rubisco酶活性的影響

2.7 NBD對馬齒莧葉片S同化、乙烯產(chǎn)量、葡萄糖含量以及光合作用和生長的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證乙烯在S介導(dǎo)馬齒莧Cd耐受性過程中的作用，利用乙烯專一性活性抑制劑NBD，研究其對Cys、Met、GSH、乙烯、Rubisco酶活性、光合速率以及干重的影響。

由圖5可知，Cd處理導(dǎo)致馬齒莧葉片Cys、Met、GSH、乙烯含量上升，添加外源S和乙烯（T4）可以進(jìn)一步提升馬齒莧葉片Cys、Met，GSH與乙烯含量。然而，在添加NBD（T5）以后，馬齒莧葉片的Cys、Met、GSH含量迅速下降，但仍高于Cd處理后水平，乙烯含量則下降至對照水平以下（圖5）。結(jié)果表明，添加NBD可導(dǎo)致乙烯活性和含量降低，繼而降低馬齒莧葉片Cys、Met、GSH含量。

圖6結(jié)果表明，馬齒莧葉片Rubisco酶活性、光合速率、干重在Cd脅迫（T1）下顯著降低，而葡萄糖含量上升。Cd脅迫處理，同時(shí)添加外源S和乙烯（T4），可誘導(dǎo)馬齒莧Rubisco酶活性、光合速率、干重顯著上升，且高于對照水平；而葡萄糖含量相對Cd處理則急劇下降，但仍然高于對照水平。NBD處理（T5）則可使Rubisco酶活性、光合速率、干重降低至對照水平以下，但仍高于Cd脅迫水平；葡萄糖含量相對Cd處理降低，但仍高于對照水平，與Cd脅迫下同時(shí)添加S和乙烯處理（T4）的含量水平相當(dāng)（圖6）。結(jié)果表明，乙烯活性和含量的降低，導(dǎo)致外源S誘導(dǎo)的馬齒莧葉片光合作用、Rubisco酶活性和生長的促進(jìn)作用受到抑制。

綜上所述，推測外源乙烯可以通過增強(qiáng)馬齒莧體內(nèi)乙烯信號(hào)途徑和S同化吸收，提升Cys、Met、GSH等硫代謝物的合成量，提高馬齒莧Cd耐受能力；同時(shí)，降低葡萄糖含量，以緩解葡萄糖誘導(dǎo)的光合抑制效應(yīng)，從而Cd脅迫下馬齒莧光合作用，促進(jìn)馬齒莧在Cd脅迫環(huán)境中的生長，緩解Cd脅迫對馬齒莧造成的毒害作用。

圖5 外源NBD對Cd脅迫下馬齒莧葉片Cys、Met、GSH與乙烯含量的影響

圖6 外源NBD對Cd脅迫下馬齒莧葉片葡萄糖含量、Rubisco酶活性、凈光合速率和干重的影響

3 討論

S是植物生長代謝必須的六大元素之一。研究表明，植物體內(nèi)的硫同化過程與植物響應(yīng)Cd脅迫緊密相關(guān)，Cd脅迫下植物的S吸收增強(qiáng)，提升Cys、Met、GSH等代謝物的合成量，以應(yīng)對Cd脅迫環(huán)境［25］。乙烯是高等植物體內(nèi)的一種重要?dú)怏w激素，調(diào)控植物種子、根、葉、花、果實(shí)等發(fā)育過程，可通過調(diào)節(jié)植物的碳代謝、糖代謝、激素代謝和蛋白質(zhì)代謝等，參與植物的逆境脅迫過程［12］。ACS是乙烯合成過程中的關(guān)鍵酶，它的激活可以促進(jìn)乙烯的合成，從而促進(jìn)植物抵御干旱、高鹽、重金屬等逆境脅迫［26］。

前人研究表明，乙烯和硫的互作，可有效降低植物對重金屬Cd的吸收，并抑制Cd誘導(dǎo)的氧化脅迫，以緩解Cd對油菜、芥菜等植物的毒害［19］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，外源S和乙烯可以有效降低Cd脅迫下馬齒莧葉片與根中的Cd含量，同時(shí)H2O2與MDA含量顯著下降。有研究表明添加外源硫化物可以與Cd形成難溶性穩(wěn)定化合物CdS而不被植物吸收［27］。同時(shí)，外源S可以促進(jìn)水稻根細(xì)胞表面鐵膠膜（Iron plaque）的形成，并限制水稻對Cd的吸收［28］。因而，外源S和乙烯處理后的馬齒莧葉片與根中Cd含量降低，可能與CdS和鐵膠膜的形成有關(guān)。

GSH是植物體內(nèi)重要的硫醇類化合物，可以與ROS直接進(jìn)行氧化還原反應(yīng)而加以清除，同時(shí)參與抗氧化劑抗壞血酸（AsA）的形成，從而組成AsAGSH循環(huán)（AsA-GSH），以維持逆境脅迫下植物ROS水平的穩(wěn)定［29-31］。Cys和Met是GSH合成必須的前體物質(zhì)，GSSG是GSH的氧化態(tài)，因而高水平的Cys、Met和氧化還原態(tài)（GSH/GSSG值），對基于AsA-GSH循環(huán)的ROS清除系統(tǒng)的功能穩(wěn)定發(fā)揮具有重要作用［6-7］。本研究中，外源S和乙烯可以促進(jìn)馬齒莧葉片中Cys、Met、GSH和氧化還原態(tài)水平，與這些硫代謝物相關(guān)的ATP-S和GR活性顯著上升，同時(shí)體內(nèi)總S含量顯著上升，以滿足這些硫醇化合物合成之需，從而有效降低馬齒莧葉片中ROS（H2O2）和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，這與Khan等［19］研究結(jié)果一致。

已有研究表明，植物體內(nèi)高水平葡萄糖可抑制葉片Rubisco酶活性，從而影響植物光合作用［32］。Cd脅迫可誘導(dǎo)芥菜型油菜體內(nèi)葡萄糖含量上升，導(dǎo)致Rubisco酶活性降低和光合抑制現(xiàn)象［33］。本研究亦發(fā)現(xiàn)Cd脅迫可導(dǎo)致馬齒莧葉片葡萄糖含量上升，而Rubisco酶活性降低，光合速率下降。添加外源S和乙烯，均可使馬齒莧葉片葡萄糖含量降低，從而提升Rubisco酶活性和光合作用。與此同時(shí)，發(fā)現(xiàn)添加外源S和乙烯可以促進(jìn)馬齒莧葉片乙烯合成關(guān)鍵酶ACS活性，并提升了乙烯含量。Iqbal等［34］研究發(fā)現(xiàn)，外源乙烯處理，可以提升不同N營養(yǎng)水平下的芥菜體內(nèi)乙烯含量，降低葡萄糖含量，從而促進(jìn)芥菜Rubisco酶活性、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳濃度、光合作用和生長發(fā)育。而缺乏乙烯受體的煙草品種，葉片Rubisco酶活性和光合作用均受到顯著影響［32］。

綜上所述，外源S和乙烯是通過誘導(dǎo)的植物體內(nèi)乙烯信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)葡萄糖和硫醇化合物（Cys、Met、GSH等）合成，從而提升馬齒莧葉片ROS清除能力和光合作用，以促進(jìn)馬齒莧在Cd脅迫環(huán)境中的生長。

為驗(yàn)證上述推論的可靠性，我們研究了乙烯活性專一性抑制劑NBD對Cd脅迫下馬齒莧生長的影響。結(jié)果表明，添加NBD（T5）以后的馬齒莧葉片Cys、Met、GSH和乙烯含量與T4（同時(shí)添加S和乙烯）相比，顯著降低。同時(shí)，NBD處理導(dǎo)致葡萄糖含量上升，Rubisco酶活性下降，凈光合速率降低和葉片干重減小。結(jié)果證實(shí)了外源S和乙烯是通過植物體內(nèi)乙烯信號(hào)途徑內(nèi)源硫醇物質(zhì)和葡萄糖的合成，增強(qiáng)SCd脅迫下植物耐光合能力。

4 結(jié)論

外源S和乙烯誘導(dǎo)馬齒莧Cd脅迫耐性的可能機(jī)理為：（1）降低植株對Cd的吸收；（2）通過提升馬齒莧體內(nèi)乙烯含量，增強(qiáng)乙烯信號(hào)途徑，增強(qiáng)S同化吸收，提升Cys、GSH等硫醇物質(zhì)的含量，從而減少活性氧的產(chǎn)生，降低膜脂質(zhì)過氧化程度。（3）通過降低Cd脅迫誘導(dǎo)的葡萄糖含量，緩解葡萄糖誘導(dǎo)的植物光合抑制作用。乙烯活性抑制劑NBD的應(yīng)用進(jìn)一步驗(yàn)證了外源S和乙烯可以通過乙烯信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)硫醇物質(zhì)和葡萄糖合成，緩解Cd脅迫對植物造成的毒害。