白蘞素灌胃治療及聯(lián)合放射治療的鼻咽癌模型小鼠腫瘤生長情況觀察

稅磊，余文興

(遂寧市中心醫(yī)院，四川遂寧629000)

鼻咽癌是臨床上較為常見的一種惡性腫瘤。環(huán)境的不斷惡化、不良生活習慣的影響均使得鼻咽癌的發(fā)病率正逐年上升［1，2]，放射治療(以下簡稱放療)是目前臨床鼻咽癌的首選治療方法［2]，疾病進展早期的療效較為顯著，可較好的抑制腫瘤生長，但當疾病進展至后期時約40%的患者會出現(xiàn)腫瘤局部復發(fā)、遠端轉(zhuǎn)移等不良事件［3]。同時放療是一種傷害性治療方法，長期放療可產(chǎn)生一系列不良并發(fā)癥，嚴重影響患者的預后。因此，尋找一種療效顯著、穩(wěn)定、不良作用輕的化療藥物是目前臨床鼻咽癌治療的研究熱點。抑制腫瘤血管生成相關研究是目前腫瘤治療研究的熱點課題之一，內(nèi)皮生長因子(VEGF)是調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的一個重要因子。增殖細胞核抗原(PCNA)是腫瘤細胞增殖過程中一個重要核抗原，可間接反應細胞增殖的活躍。白蘞素是一種黃酮類化合物，又稱二氫楊梅素(DMY)，具有鎮(zhèn)痛、祛痰、止咳、消炎等療效［4]。最新研究［5～7]結果顯示，在抗腫瘤方面白蘞素也具有不錯的效果，可明顯抑制癌細胞的遷移、侵襲，同時促進癌細胞的凋亡，抑制腫瘤多藥耐藥的發(fā)生。目前未見有關白蘞素對鼻咽癌的治療作用及其相關機制報告。2019年2～4月，我們構建鼻咽癌小鼠模型，觀察白蘞素灌胃治療及聯(lián)合放療的鼻咽癌模型小鼠腫瘤生長情況，并探討白蘞素的可能作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物及儀器 50只體質(zhì)量(19±1)g的雄性清潔級BALB/c(nu/nu)裸小鼠，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2008－0016，由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司。鼻咽癌CNE－2細胞系購自上海細胞生物所。白蘞素，批號17031501，購自國家標準物質(zhì)網(wǎng);鼠PCNA抗體及鼠VEGF抗體均購自Sant Cruz公司;RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購自GIBICO公司。

1.2 鼻咽癌小鼠模型構建 取CNE－2細胞進行體外培養(yǎng)，取生長期細胞懸浮液0.2 mL接種于50只小鼠體內(nèi)，制備鼻咽癌小鼠模型，造模7 d左右小鼠開始出現(xiàn)腫瘤，出現(xiàn)的時間和腫瘤直徑略有差別，最晚于接種后第10天出現(xiàn)，起初均為接種部位出現(xiàn)可觸及的綠豆大小的瘤塊，并隨著時的延長而逐漸增大，每7天測量一次腫瘤直徑。接種21 d時有48只鼠腫瘤直徑在(200±100)mm3之間，兩只腫瘤直徑＜100 mm3的鼠予以剔除，最終納入48只小鼠。

1.3 鼻咽癌模型小鼠分組及白蘞素給予方法 48只小鼠均分為四組，分別為模型對照組、白蘞素組、放療組、白蘞素+放療組，每組12只。模型對照組每天生理鹽水灌胃，灌胃體積0.1 mL/10 g;白蘞素組每天50 mg/kg白蘞素灌胃，灌胃體積0.1 mL/10 g;白蘞素+放療組每天50 mg/kg的白蘞素灌胃，灌胃體積0.1 mL/10 g，進行腫瘤局部單次8 Gy照射;放療組每天灌胃生理鹽水，灌胃體積0.1 mL/10 g，然后給予腫瘤局部單次8 Gy照射，各組均干預21 d。

白蘞素+放療組白蘞素+放療組1.4各組腫瘤體積、抑瘤率測算 干預1、7、14、21、28 d 時測量腫瘤體積，共測量5次，測量方法如下：用游標卡尺準確測出腫瘤的長直徑(a)與短直徑(b)，測算腫瘤體積，腫瘤體積=(ab－a2)/6，干預28 d測量腫瘤體積后處死動物，小心剝離腫瘤組織，將腫瘤組織立即浸入足量的10%多聚甲醛溶液中固定，計算各組的抑瘤率(%)，抑瘤率=(1－實驗組平均腫瘤體積/模型對照組平均腫瘤體積)×100%。重復3次，取平均值。

1.4 各組腫瘤組織VEGF、PCNA檢測 采用免疫組化法。取各組腫瘤組織，10%多聚甲醛中固定24 h，小心切取大小適中的組織于包埋盒中，蒸餾水沖洗后經(jīng)過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片后采用免疫組織化學技術檢測各組腫瘤組織VEGF、PCNA。結果判定：VEGF表達于細胞質(zhì)中，陽性細胞光鏡下細胞質(zhì)中有大量棕黃色顆粒，VEGF表達量越多，顏色越深，棕黃色顆粒就越多，每組均于10×40倍鏡下隨機拍攝20張圖片輸入IPP彩色病理圖文分析系統(tǒng)計算光密度值進行量化分析，最后取平均光密度值進行比較分析，平均光密度值=光密度值之和/面積之和，平均光密度值越大，說明VEGF表達量越高;PCNA表達于細胞核中，陽性細胞可見細胞核被染成棕黃色，每組均于10×40倍鏡下隨機計數(shù)清晰視野中的細胞500個，同時記錄棕黃色細胞數(shù)，用棕黃色細胞數(shù)/500再乘以100%即為PCNA增殖指數(shù)，最后取PCNA增殖指數(shù)進行比較分析，PCNA增殖指數(shù)越高，說明腫瘤細胞增殖越活躍。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行處理。計量資料以±s表示，組間兩兩比較采用LSD法，若資料不滿足方差分析條件則采用非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠腫瘤體積及抑瘤率比較 干預第1、7、14、21、28天時各組小鼠腫瘤體積比較見表1。白蘞素+放療組白蘞素+放療組白蘞素+放療組干預28 d時，放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組抑瘤率分別為 34.27% ±5.13%、27.93% ±4.75%、48.60% ±6.20%，與放療組、白蘞素組比較，白蘞素+放療組抑瘤率高(P均＜0.05)。

表 1 干預 1、7、14、21、28 d 時各組小鼠腫瘤體積比較(mm3，±s)

表 1 干預 1、7、14、21、28 d 時各組小鼠腫瘤體積比較(mm3，±s)

注：與模型對照組比較，*P＜0.05;與白蘞素組比較，#P＜0.05;與放療組比較，※P＜0.05。

組別28 d白蘞素組 122.82 ±68.29 206.04 ± 79.00 194.23 ±122.87* 187.37 ±25.94* 168.78 ±22.95腫瘤直徑干預1 d 干預7 d 干預14 d 干預21 d 干預＊※白蘞素 +放療組 121.00 ±77.04 204.23 ±112.87 170.37 ±101.94* 141.78 ±54.95* 120.37 ±47.87*#※放療組 121.94 ±41.62 202.16 ± 84.67 176.84 ± 68.75 156.48 ±20.73 153.93 ±24.03*模型對照組 122.70 ±37.15 222.86 ± 60.29 231.87 ± 64.81 255.26 ±19.49 234.19 ±11.12

2.2 各組腫瘤組織VEGF表達量比較 模型對照組、放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織VEGF 表達量分別為0.041 ±0.004、0.017 ±0.004、0.015 ±0.002 和 0.003 ±0.002，與模型對照組比較，放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織VEGF表達量降低(P均＜0.05)，放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織VEGF表達量兩兩比較，P 均 ＜0.05。

2.3 各組腫瘤組織PCNA增殖指數(shù)比較 模型對照組、放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織PCNA增殖指數(shù)分別為31.02% ±2.45%、17.04%±2.55%、10.36% ±3.15% 和 9.15% ±1.72%，與模型對照組比較，放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織PCNA增殖指數(shù)降低(P均＜0.05)，放療組、白蘞素組、白蘞素+放療組腫瘤組織PCNA增殖指數(shù)兩兩比較，P均＜0.05。

3 討論

近年鼻咽癌的發(fā)病率越來越高，已成為臨床上常見的惡性腫瘤之一。目前臨床上治療鼻咽癌的主要措施為放射治療，這與鼻咽癌特殊的生物學行為、病理類型以及解剖學結構等因素有關，但是放射治療僅對早期患者效果明顯，并且5年生存率仍然低于60%，對于晚期患者進行放射治療，5年生存率更低，因為晚期患者在治療過后很容易出現(xiàn)局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移等并發(fā)癥，最終導致治療失?。?.9]，因此降低鼻咽癌患者的復發(fā)率和遠端轉(zhuǎn)移是目前急需解決的問題之一。在進行放射治療的時候不僅可以殺死癌細胞，也可以殺死人體正常的組織細胞，特別是對于造血系統(tǒng)損害較大，因此在進行放射治療后，患者會出現(xiàn)一系列并發(fā)癥。目前認為鼻咽癌的發(fā)生與多個因素有關，包括環(huán)境因素、遺傳因素、個人生活習慣及EB病毒感染，這些因素都會不同程度導致鼻黏膜纖毛輸送功能受損，最終引發(fā)鼻咽癌。白蘞素主要活性成分為黃酮類化合物，具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、消炎等多種奇特功效，因此本次研究將其用于聯(lián)合治療鼻咽癌，觀察其抗腫瘤活性。

眾所周知，腫瘤細胞的生長繁殖有賴于新生毛細血管的生成，抑制腫瘤血管生成相關的研究是目前研究的熱點課題之一，白蘞素對血管生成具有一定的抑制作用，它是否可以通過這一重要機制來抑制腫瘤細胞的生長目前還不得而知，也未見相關報道。本研究首先探討了白蘞素與鼻咽癌細胞生長的關系，結果發(fā)現(xiàn)它可明顯的抑制腫瘤細胞的生長，連續(xù)灌胃給藥21天進行干預后，對腫瘤細胞的抑制作用與放射治療無明顯差異，并且與放射治療聯(lián)合使用時可取得更好的抑制作用，這間接的說明兩種治療措施抑制腫瘤細胞生長的途徑不同，同時使用這兩種療法，可以通過不同的機制抑制腫瘤細胞生長，從而提高治療效果，但是對兩種措施進行綜合比較后發(fā)現(xiàn)，盡管對腫瘤的抑制作用都較好，但是各有其優(yōu)缺點，放射治療起效快，但是對患者身體的不良反應較大，白蘞素盡管還未發(fā)現(xiàn)明顯的不良作用，但是起效慢，需要進行連續(xù)21天的大劑量治療，并且治療效果尚需及進一步大樣本研究。雖然通過本次研究還不能肯定是否可將它應用于臨床取代放射治療來治療鼻咽癌，但是明確了其在抑制鼻咽癌細胞生長時的效果，為今后的臨床應用提供了基礎。

調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的一個重要因子就是VEGF，它不僅對血管內(nèi)皮細胞的增殖分化具有明顯的促進作用，而且還可以促進內(nèi)皮細胞的遷移，這是因為它可以促進，間質(zhì)膠原酶和金屬蛋白酶的生成，由于它具有這些重要的生物學活性，因此它的高表達可以明顯的促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和浸潤，這也是腫瘤細胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的一個重要機制，同時也是一個重要的預測因子［10]。通過本次研究發(fā)現(xiàn)，白蘞素治療和放療均可明顯明顯減少腫瘤組織中VEGF的表達，對腫瘤細胞的生長具有明顯的抑制作用，并且這種抑制作用在聯(lián)合使用時更強，VEGF的表達也更低，這說明白蘞素抑制腫瘤細胞生長的一個重要機制就是抑制VEGF的表達。

PCNA與腫瘤細胞的DNA合成有緊密的關系，是腫瘤細胞增殖過程中一個重要的核抗原，處于增殖期的細胞核中均有該抗原的表達，他表達量的增高可間接的反應出細胞增殖的活躍。在本次研究結果中發(fā)現(xiàn)，模型對照組中腫瘤細胞的PCNA表達量高于其他三組，說明該組的腫瘤細胞增殖活躍，而其他三組通過施加相應的干預措施后，腫瘤細胞的生長增殖受到了抑制，且差異有統(tǒng)計學意義，并且白蘞素治療和放療差異無統(tǒng)計學意義，說明二者在治療鼻咽癌的時候都具有不錯的效果，都可以有效抑制腫瘤細胞新生毛細血管的生成，從而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用，并且這種治療效果在聯(lián)合使用時更強。盡管這些機制還不完全清楚，但是有相關研究［11]認為，在進行抗腫瘤治療的時候正確的使用血管生成抑制劑，可改善腫瘤的微環(huán)境，使得異常增生的毛細血管趨于正常，幫助抗腫瘤藥物順利到達靶器官，同時由于腫瘤組織新生毛細血管的形成受到抑制，這也使得腫瘤組織的營養(yǎng)物質(zhì)和氧的供應受到抑制，從而抑制腫瘤細胞的生長。

綜上所述，白蘞素可抑制鼻咽癌小鼠的腫瘤生長，白蘞素灌胃治療及聯(lián)合放療抑制鼻咽癌小鼠腫瘤生長的效果優(yōu)于白蘞素灌胃。白蘞素的可能作用機制為抑制腫瘤組織PCNA、VEGF的表達。白蘞素、放療二者可能協(xié)同抑制腫瘤組織PCNA、VEGF的表達。本次研究僅初步探討了白蘞素抗腫瘤活性及其作用機制，但是還需進行更深入的研究來肯定其療效，同時也需要檢測更多的指標來全面分析其作用機制。