類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑膜液淋巴細(xì)胞CD25、HLA-DR的表達(dá)特征分析

河南省焦作市第二人民醫(yī)院（454000）楊金玲

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一類以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病，具體病因還在研究中，目前未有較明確說(shuō)法[1]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要表現(xiàn)為手、足小關(guān)節(jié)的對(duì)稱性、多關(guān)節(jié)、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥，普遍伴關(guān)節(jié)外器官受累以及血清類風(fēng)濕因子陽(yáng)性，如嚴(yán)重者可致使關(guān)節(jié)出現(xiàn)畸形或功能喪失[2]?；谙嚓P(guān)研究表明，自身免疫性疾病的產(chǎn)生不光和免疫系統(tǒng)接觸隱蔽抗原有關(guān)，免疫功能紊亂也是形成此項(xiàng)疾病的關(guān)鍵[3]。本文采用流式細(xì)胞儀對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑膜液淋巴細(xì)胞CD25、HLA-DR的表達(dá)特征進(jìn)行分析，從而對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制行進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床治療的開(kāi)展提供一定依據(jù)，現(xiàn)行研究如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院收治的31例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者患者作為本次研究對(duì)象，所選31例患者均符合類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。觀察組關(guān)節(jié)滑膜液取自我院骨科，行膝關(guān)節(jié)置換或滑膜切除。其中女性23例，男性8例，年齡在29～56歲，平均年齡（38.41±6.34）歲。對(duì)照組27例，所選人群關(guān)節(jié)滑膜液取自由于外傷行截肢的正常人，其中女性18例，男性9例，年齡在23～50歲，平均年齡（36.22±6.41）歲。對(duì)照組與觀察組兩組患者資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

附表 滑膜液淋巴細(xì)胞CD25、HLA-DR表達(dá)對(duì)比

1.2 方法 關(guān)節(jié)滑膜液淋巴細(xì)胞分離。選用20IU/ml肝素抗凝為關(guān)節(jié)滑膜液，3000r/min×10min離心，棄上清，在沉淀物中加入PBS重懸，制備淋巴細(xì)胞1500r/min×15min，選用淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）分離，將細(xì)胞的濃度調(diào)至1×106/ml，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，6h內(nèi)結(jié)束。

免疫熒光染色。在FALCON試管（出品公司：美國(guó)BD）內(nèi)添加20μl異硫氰基熒光素（FITC）標(biāo)記的抗CD19單抗、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗HLA-DR單抗或抗CD25單抗、葉綠素蛋白（PerCP）標(biāo)記的抗CD3單抗與三色同型對(duì)照免疫球蛋白，將其分別與100μl 1×106/ml細(xì)胞數(shù)的關(guān)節(jié)滑膜液行充分混勻，置于室溫暗處行15min反應(yīng)，后加入0.5ml PBS，充分混勻，24h內(nèi)上流式細(xì)胞儀行嚴(yán)密分析。

流式細(xì)胞分析。采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀，開(kāi)機(jī)后以CaliBRITE 3熒光微球與FACS Comp自動(dòng)軟件對(duì)儀器靈敏度進(jìn)行檢查，對(duì)實(shí)驗(yàn)的獲取條件行自動(dòng)設(shè)定，其中包括熒光補(bǔ)償以及光電倍增管（PMT）電壓等，接著以CellQuest軟件用樣本對(duì)實(shí)驗(yàn)獲取條件行進(jìn)一步優(yōu)化，并對(duì)各組樣本管進(jìn)行檢測(cè)，獲取104個(gè)細(xì)胞，最后對(duì)各類CD分子在淋巴細(xì)胞中免疫熒光陽(yáng)性細(xì)胞的百分率行CellQuest軟件分析。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察患者滑膜液淋巴細(xì)胞CD25、HLA-DR表達(dá)，其中包括T淋巴細(xì)胞（CD3+CD25+、CD3+HLA-DR+）與B淋巴細(xì)胞（CD19+CD25+、CD19+HLA-DR+）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 建立Excel數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析，分析軟件工具SPSS20.0，計(jì)量資料采用均數(shù)方差表示且用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示且用X2檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2 結(jié)果

對(duì)觀察組與對(duì)照組兩組人群實(shí)行滑膜液淋巴細(xì)胞CD25、HLA-DR表達(dá)對(duì)比，具體分析見(jiàn)附表。兩組人群關(guān)節(jié)滑膜液表達(dá)CD25的B淋巴細(xì)胞與表達(dá)HLA-DR的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一類關(guān)節(jié)疾病，其具有慢性、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，目前發(fā)病機(jī)制不明確。從目前研究來(lái)看，普遍認(rèn)為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎是由于類風(fēng)濕因子所引發(fā)[4]。通過(guò)研究表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和免疫功能紊亂有一定 聯(lián)系，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)內(nèi)與全身免疫反應(yīng)過(guò)程中有許多復(fù)雜因子的參與[5]。CD25、HLA-DR細(xì)胞活化標(biāo)志，在本實(shí)驗(yàn)中，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑膜液表達(dá)CD25的B淋巴細(xì)胞與表達(dá)HLA-DR的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞與對(duì)照組相比，出現(xiàn)明顯增多現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其結(jié)果表明類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者在關(guān)節(jié)滑膜液中發(fā)生活化T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞明顯增多特征。而免疫活性細(xì)胞的增多則表明了患者全身或局部免疫功能亢進(jìn)。相關(guān)學(xué)者認(rèn)為，活化T淋巴細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎致病機(jī)制中有著重要作用，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫反應(yīng)的激發(fā)與延續(xù)是活化T淋巴細(xì)胞對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞、其他抗原細(xì)胞遞呈抗原多肽的自身反應(yīng)造成[6]。B淋巴細(xì)胞會(huì)被激活動(dòng)T淋巴細(xì)胞促使產(chǎn)生免疫球蛋白，依據(jù)接觸依賴性，非依賴性機(jī)制對(duì)單核細(xì)胞行側(cè)記，促使細(xì)胞因子的分泌，這在誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥狀中有著巨大的作用[7]?；罨腂淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生自身抗體，同時(shí)又具備抗原遞呈功能，其在抗原濃度較低的二次免疫反應(yīng)階段特別重要。淋巴細(xì)胞被激活普遍是由于協(xié)同刺激分子和與之相應(yīng)配體的存在，其重要途徑為CD28和CD80/CD86分子之間的相互作用，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，CD28和CD80/CD86分子不只是淋巴細(xì)胞活化的重要協(xié)同刺激信號(hào)，其在淋巴細(xì)胞亞群分化例里也有著十分重要的作用[8]。體內(nèi)的細(xì)胞因子也能夠?qū)喨夯罨约傲馨图?xì)胞行調(diào)節(jié)，研究表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中，抗炎性的白細(xì)胞介素4（IL-4）對(duì)輔助性T淋巴細(xì)胞亞群的激活可以起到有效作用。所以在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳遞行改變，對(duì)促炎性細(xì)胞因子與抗炎性細(xì)胞因子的分泌維系平衡，阻斷淋巴細(xì)胞過(guò)度激活等，可以作為治療新思路。

綜上所述，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑膜液淋巴細(xì)胞CD25、HLA-DR的表達(dá)特征分析中可以發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)滑膜液淋巴細(xì)胞CD25、HLA-DR的表達(dá)特征為增高，免疫機(jī)能亢進(jìn)，同時(shí)基于研究與相關(guān)資料查詢表明，關(guān)節(jié)滑膜液淋巴細(xì)胞CD25、HLADR在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病機(jī)制中有重要作用。