深海三文魚(yú)蛋白（肽）抗疲勞作用的實(shí)驗(yàn)研究

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心（100700）董陳潁 李雪麗 安婉麗 邸莎 孔冉 楊鴻

榮成鴻德海洋生物科技有限公司（264300）周偉

三文魚(yú)，又名鮭魚(yú)，學(xué)名鮭科（Salmonidae），屬于動(dòng)物界，脊索動(dòng)物門(mén)，輻鰭魚(yú)綱，新鰭亞綱，真骨下綱，原棘鰭總目，鮭形目，鮭科。共有300多個(gè)屬種，比較有代表性的鮭魚(yú)有大西洋鮭魚(yú)、太平洋鮭魚(yú)、大馬哈魚(yú)等。主要分布在太平洋北部及歐洲、亞洲、美洲的北部地區(qū)。其營(yíng)養(yǎng)成分豐富，具有預(yù)防心血管疾病、補(bǔ)充人體礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)及美容養(yǎng)顏等功效[1]，有很高的食用價(jià)值，是世界著名的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一。疲勞通常是由于過(guò)度活動(dòng)并且缺乏休息所致的人體自然反應(yīng)，大致可分為精神上和肉體上。有文獻(xiàn)報(bào)道，補(bǔ)充氨基酸可以直接用做細(xì)胞燃料，維持大腦的正常的興奮性，恢復(fù)機(jī)體代謝掉的蛋白質(zhì)，有利于延緩中樞疲勞的出現(xiàn)及促進(jìn)體力的恢復(fù)[2]。研究報(bào)道三文魚(yú)蛋白質(zhì)含量較高，且必需氨基酸種類(lèi)齊全、比例適宜，有利于人體對(duì)其蛋白質(zhì)（肽）的吸收[3]。筆者推測(cè)將三文魚(yú)進(jìn)行提取加工制成三文魚(yú)蛋白（肽）粉，可以有效的補(bǔ)充人體氨基酸，從而提高機(jī)體對(duì)疲勞的耐受。但查閱相關(guān)文獻(xiàn)，目前未見(jiàn)有關(guān)三文魚(yú)抗疲勞的研究。為此，我們分析了三文魚(yú)蛋白（肽）的氨基酸成分，進(jìn)行了小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、小鼠游泳后血清尿素氮（BUN）、肝糖原含量測(cè)定，以此來(lái)評(píng)價(jià)深海三文魚(yú)蛋白（肽）的抗疲勞作用。研究報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

受試樣品及藥品、儀器：①深海三文魚(yú)蛋白（肽），淡黃色粉末，由榮成鴻德海洋生物科技有限公司提供，批號(hào)：20150202，規(guī)格：400g/袋。②尿素氮(BUN)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：2015050；③小鼠肝糖原elisa試劑盒，上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)：201505；④PBS緩沖液，Beijing Sdarbio Science &Technology Co.,Ltd，批號(hào)：20141204；⑤多功能酶標(biāo)儀，BioTek Instrument，Inc 產(chǎn)品；⑥德國(guó)SYKAM全自動(dòng)氨基酸分析儀S-433D。

附表1 深海三文魚(yú)蛋白（肽）抗疲勞實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化（x±SD）

附表2 深海三文魚(yú)蛋白（肽）對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響（x±SD）

附表3 深海三文魚(yú)蛋白（肽）對(duì)小鼠血清尿素氮、肝臟肝糖原水平的影響（x±SD）

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 深海三文魚(yú)蛋白（肽）配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取原料樣品72g、36g、18g，蒸餾水配至200ml，混勻后作為受試藥物備用。給藥劑量分別為21.6、10.8、5.4g/kg。

2.1.2 運(yùn)動(dòng)耐力試驗(yàn)（負(fù)重游泳試驗(yàn)） 方法：選健康成年清潔級(jí)昆明種雄性小鼠，體重18～20g，飼養(yǎng)于室溫21.0～22.0℃，相對(duì)濕度（45～49）%RH的屏障環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢疫3天，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、深海三文魚(yú)蛋白（肽）大、中、小劑量組（給藥劑量分別為21.6、10.8、5.4g/kg）。經(jīng)口灌胃給予深海三文魚(yú)蛋白（肽）混懸液，連續(xù)給予受試物30d。每5天記錄各組小鼠體重。于末次給樣30min后，距鼠尾端1/3處負(fù)小鼠體重5%的鉛皮，放入水溫為25℃（水溫正負(fù)0.5℃）、40cm×60cm×36cm的游泳箱中。每一批小鼠下水之前均將水溫調(diào)至25℃，并將室溫恒定在25℃。每只水箱一次放入4只小鼠，分別為正常對(duì)照組、深海三文魚(yú)蛋白（肽）大、中、小劑量組各一只。用秒表記錄自游泳開(kāi)始至淹沒(méi)兩次的時(shí)間，該時(shí)間為小鼠的游泳時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果用t檢驗(yàn)。如果受試物組游泳時(shí)間比對(duì)照組長(zhǎng)，且差異有顯著性，則可判斷為該受試物可延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間。

2.1.3 血清尿素氮及肝糖原的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥同2.1.2。末次給樣30min后，將小鼠置于水溫為30℃的游泳箱中不負(fù)重游泳90min(每箱一次放入5只，每組各一個(gè)游泳箱)，做完一批，間隔10min放入第二批。每次入水前均將水溫調(diào)至30℃，室溫恒定在25℃。運(yùn)動(dòng)后休息60min，將眼睛周?chē)粮蓛?，拔眼球取血約0.5mL，4℃ 3000rpm離心10mim，分離血清-80℃凍存?zhèn)溆?。取血后處死小鼠，取肝。將肝置于冰上的平皿?nèi)，經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱(chēng)取＜100mg的肝組織放入離心管內(nèi)，-80℃凍存?zhèn)溆?。分別按照血尿素氮（BUN）試劑盒及小鼠肝糖原（Glycogen）elisa試劑盒進(jìn)行血清中尿素氮測(cè)定及肝組織肝糖原的測(cè)定。

2.2 深海三文魚(yú)蛋白（肽）氨基酸檢測(cè)方法 根據(jù)國(guó)標(biāo)5009.124，取三文魚(yú)干粉19.3mg，使用6mol/L鹽酸進(jìn)行水解后采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 體重變化 連續(xù)給予深海三文魚(yú)蛋白（肽）30d，每5天記錄各組小鼠體重至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。結(jié)果顯示給予受試物5天時(shí)，深海三文魚(yú)蛋白（肽）大中小劑量組平均體重均高于正常對(duì)照組（P<0.05，P<0.01）；給藥20天和25天，大、中劑量組體重低于正常對(duì)照組（P<0.05，P<0.01）；給藥30天，三個(gè)劑量組體重均顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01）。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附表1。

3.1.2 負(fù)重游泳時(shí)間 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，深海三文魚(yú)蛋白（肽）大、中、小劑量組小鼠的力竭游泳時(shí)間均比正常對(duì)照組顯著增加(P<0.01)，表明深海三文魚(yú)蛋白（肽）具有明顯的小鼠力竭游泳的抗疲勞作用。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附表2。

3.1.3 血清尿素氮、 肝糖原的測(cè)定 由附表3可知，深海三文魚(yú)蛋白（肽）大劑量組小鼠在劇烈運(yùn)動(dòng)休息后，尿素的產(chǎn)生比對(duì)照組有明顯的下降(P<0.05)；說(shuō)明深海三文魚(yú)蛋白（肽）大劑量組具有增強(qiáng)機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷耐受能力的功效；深海三文魚(yú)蛋白（肽）各個(gè)劑量組的肝糖原比對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 說(shuō)明不具有增加機(jī)體糖原儲(chǔ)備的功效。

3.2 氨基酸檢測(cè)結(jié)果 本次檢測(cè)根據(jù)國(guó)標(biāo)測(cè)定食物中氨基酸的方法，適用于食品中酸水解氨基酸的測(cè)定，包括天冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，谷氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，組氨酸，賴(lài)氨酸和精氨酸共16中氨基酸。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定，深海三文魚(yú)蛋白肽中含有的16種氨基酸的含量所占比例見(jiàn)附表4?？偘被岷空忌詈Ｈ聂~(yú)蛋白（肽）的85.6%，其中呈味氨基酸：甘氨酸，谷氨酸，天門(mén)冬氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸及酪氨酸含量為43.4%，占全部氨基酸的50%以上。必需氨基酸及半必需氨基酸：賴(lài)氨酸，亮氨酸，纈氨酸，蘇氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，精氨酸及組氨酸含量為51.3%，占全部氨基酸的60%左右。支鏈氨基酸：亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸 含量為11.3%，占全部氨基酸的13%以上。

附表4 深海三文魚(yú)蛋白（肽）氨基酸組成及含量（mg/19.3mg,干重）

4 討論與結(jié)論

疲勞為機(jī)體生理過(guò)程不能持續(xù)其機(jī)能在某一特定的水平和/或不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)耐力的下降，故常采用負(fù)重游泳試驗(yàn)對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力進(jìn)行考察[4]，從而反映機(jī)體的機(jī)能水平、抗疲勞能力的大小。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：深海三文魚(yú)蛋白（肽）大、中、小劑量組可增加小鼠的力竭游泳時(shí)間，表明深海三文魚(yú)蛋白（肽）大、中、小劑量組具有明顯的抗疲勞作用。

糖、脂肪、蛋白質(zhì)是機(jī)體的三大功能物質(zhì)。而糖是機(jī)體組織能量的重要來(lái)源，在機(jī)體的運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，首先消耗肌糖原，而隨著肌糖原的消耗，機(jī)體會(huì)分解肝糖原，繼續(xù)供能，增加肝糖原的儲(chǔ)備量，可以為機(jī)體提供更多的能量，達(dá)到抗疲勞的目的[5]；如果長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)，機(jī)體可利用的糖耗竭時(shí)，蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝加強(qiáng)，則血尿素氮的含量增加。小鼠身體對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)性增強(qiáng)，則蛋白質(zhì)和氨基酸分解減少[6]，因此肝糖原、血尿素氮可以用來(lái)反映機(jī)體抗疲勞的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：深海三文魚(yú)蛋白（肽）雖然不具有增加機(jī)體糖原儲(chǔ)備的功效，但是可以減少血尿素的產(chǎn)生量，說(shuō)明深海三文魚(yú)蛋白（肽）具有增強(qiáng)機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷耐受能力的功效。

運(yùn)動(dòng)情況下甘氨酸是人體重要能源物質(zhì)——肌酸的重要原料[7]，甘氨酸預(yù)先補(bǔ)充后可部分地阻抑機(jī)體補(bǔ)體活性的大幅度下降和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的下降，并可對(duì)操作能力發(fā)揮促進(jìn)作用，提示甘氨酸在運(yùn)動(dòng)情況下可成為特殊的“必需氨基酸”。甘氨酸預(yù)先補(bǔ)充4周可顯著延長(zhǎng)小鼠力竭性游泳的時(shí)間[8]。谷氨酸可以通過(guò)增加肝糖原和肌糖原的貯備，增加機(jī)體耐力；提高CPK活性，促進(jìn)機(jī)體肌酸磷酸的積累與轉(zhuǎn)化為ATP，給機(jī)體供能；抑制LDH活性，進(jìn)而減少乳酸的生成；進(jìn)而極顯著提高小鼠的游泳耐力[9]。天門(mén)冬氨酸是草酰乙酸的前體，參與三梭酸循環(huán)，草酰乙酸的增加可以提高三梭酸循環(huán)的速度，促進(jìn)糖和脂肪在運(yùn)動(dòng)中的有氧代謝能力，防止運(yùn)動(dòng)疲勞的產(chǎn)生[10]。天門(mén)冬氨酸在機(jī)體內(nèi)可進(jìn)人肝臟和腎臟參與無(wú)氧代謝，經(jīng)糖異生作用生成葡萄糖或糖原，提高機(jī)體內(nèi)血糖含量，其形成的草酸乙酸也可以在無(wú)氧的條件下直接經(jīng)糖異生轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃?，從而提高血糖濃度和肌糖原?chǔ)備，提高無(wú)氧供能能力[11]。L-精氨酸經(jīng)人體內(nèi)三種NOS同工酶催化分解產(chǎn)生內(nèi)源性NO，內(nèi)源性NO具有舒張血管，改善循環(huán)系統(tǒng)、提高氧利用率的作用。氨在運(yùn)動(dòng)時(shí)由肌肉產(chǎn)生并釋放到血液，血氨濃度升高，在腦中積累，進(jìn)而影響腦機(jī)能，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疲勞，降低運(yùn)動(dòng)能力。而精氨酸在體內(nèi)可參與鳥(niǎo)氨酸循環(huán)，提高體內(nèi)精氨酸的含量，使肝臟內(nèi)鳥(niǎo)氨酸循環(huán)速度加快，提高氨的清除速度，防止運(yùn)動(dòng)疲勞的產(chǎn)生。研究結(jié)果顯示L-Arg顯著延長(zhǎng)負(fù)重游泳時(shí)間，降低糖無(wú)氧酵解引起的乳酸積累，從而產(chǎn)生抗疲勞效果。亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，這三種氨基酸因其分子組成中都有支鏈而又被稱(chēng)為支鏈氨基酸(Branched-chain Amino Acids, BCAA)。BCAA可通過(guò)抑制血液中色氨酸進(jìn)入腦部，從而減少5-羥色胺(5-HT)的生成，發(fā)揮抗中樞疲勞作用；通過(guò)清除過(guò)自由基及加速肌肉蛋白質(zhì)的合成，抑制機(jī)體蛋白質(zhì)的分解，從而減輕外周肌肉組織損傷，加快運(yùn)動(dòng)后機(jī)體的修復(fù)，起到抗外周性疲勞作用；補(bǔ)充BCAA可促進(jìn)糖的異生作用，減少骨骼肌乳酸的積累，延緩疲勞的發(fā)生和促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后疲勞的消除。此外，BCAA作為一類(lèi)特殊參與供能氨基酸，是長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)參與供能的重要氨基酸。

通過(guò)測(cè)定深海三文魚(yú)蛋白（肽）所含氨基酸的種類(lèi)及含量發(fā)現(xiàn)，其含有的甘氨酸，谷氨酸，天門(mén)冬氨酸，精氨酸及支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）是有效的抗機(jī)體疲勞的氨基酸。其含量約占全部氨基酸的60%左右。而且其必需氨基酸和半必需氨基酸含量豐富，是很好的機(jī)體氨基酸補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)劑。筆者的研究顯示深海三文魚(yú)蛋白（肽）具有多種抗疲勞的有效氨基酸，能顯著延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間，降低血清尿素氮含量，具有明顯的抗疲勞作用，是一種很有前景的高質(zhì)量蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。