大鼠體內百草枯組織分布研究

李鵬飛 范家明 劉 河 張 茜 安卓玲 劉麗宏

(首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院藥事部, 北京 100020)

百草枯(paraquat，PQ)又稱對草快、克蕪蹤，屬聯吡啶雜環(huán)化合物，為速效觸殺型、滅生性季胺鹽類除草劑，在我國農林行業(yè)廣泛使用，目前尚無替代品[1]。百草枯對人毒性極大，且無特效藥，口服中毒病死率可達90%以上，百草枯可導致肝、腎等多器官衰竭，肺部不可逆纖維化和呼吸衰竭[2-3]。百草枯的致毒機制目前尚未闡明，研究[4]顯示百草枯是一電子受體，吸收入體后通過一系列作用引起細胞內超氧化陰離子自由基及過氧化氫過量，引起組織器官細胞膜脂質過氧化，從而造成多系統(tǒng)組織器官的損害。百草枯在人體的毒代動力學尚不清楚。初步的毒代動力學研究[5-6]顯示，百草枯可經皮膚、呼吸道和消化道不完全吸收，隨血液分布至全身各組織器官，肺中含量較高，達到血中含量的十至數十倍。百草枯在體內很少降解，常以完整的原形物隨糞、尿排出，少量可經乳汁排出。研究[7-9]顯示，百草枯血漿質量濃度僅能間接反映百草枯體內情況，并不能代表受損傷器官中毒物濃度，研究中應重點關注各靶器官的損傷和器官衰竭情況。本研究采用高效液相色譜-質譜聯用法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)測定方法，系統(tǒng)性研究了染毒下百草枯在大鼠體內多個組織中的分布情況，為百草枯毒性機制的進一步研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大鼠，雄性，體質量220～240 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 儀器與試劑

5500 QTRAP型液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源(electrospray ionization，ESI)以及Analyst 1.6數據處理軟件，美國Sciex公司；島津20A高效液相色譜系統(tǒng)，包括液相泵、自動進樣器、柱溫箱等，日本島津公司。BP211D型十萬分之一分析天平，德國Sartorius公司。Direct 8型Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國密理博公司。百草枯對照品，含量為99.8%，批號：856177-250 MG，百草枯-d8對照品，含量為98.0%，批號：50636-5 MG，均購自美國Sigma公司。其他試劑均為色譜均，超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.3 百草枯組織樣本LC-MS/MS測定方法建立

1.3.1 溶液的配制

校正曲線和質控樣本的配制：精密稱取10 mg百草枯對照品，加入對應體積的乙腈-水(1∶1)溶解并渦旋，配制1 g/L的百草枯儲備液。精密量取百草枯儲備液，用空白組織勻漿提取液逐級稀釋至校正曲線樣本所需濃度1、2、5、10、20、50、100 μg/L。重新稱量并配制質控用儲備液，精密量取并用空白組織勻漿提取液逐級稀釋至質控樣本所需濃度 3、15、80 μg/L。內標溶液的配制：精密稱取10 mg百草枯-d8對照品，加入乙腈-水(1∶1)充分溶解，配制成1 g/L的內標儲備液。取適量內標儲備液用乙腈逐級稀釋至100 μg/L的百草枯-d8內標溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters Acclaim Trinity Q1色譜柱(3.0 mm×50.0 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水[100 mmol/L甲酸銨、0.4%(體積分數)甲酸]，流速：0.8 μL/min(1∶1分流)，梯度洗脫(表1)；進樣量：10 μL。

表1 梯度條件Tab.1 Conditions of gradient elution

1.3.3 質譜條件

離子源： ESI，正離子模式；離子噴射電壓：5 500 V；溫度：550 ℃；鞘氣壓力：379.2 kPa；霧化氣壓力：379.2 kPa；氣簾氣壓力：158 kPa；碰撞氣壓力設為Medium；以上氣體均使用高純氮氣；掃描方式為多重反應監(jiān)測。百草枯和百草枯-d8解簇電壓：50 V、140 V；碰撞能量：16 eV、15 eV；百草枯和百草枯-d8定量分析的離子對分別為質譜比(m/z)93.1→171.1和m/z97.1→179.2，百草枯用于定性考察的離子對為m/z186.1→171.1。

1.4 大鼠實驗設計及組織樣本采集

大鼠飼養(yǎng)于清潔動物房內，所有的實驗操作均符合首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學研究中心實驗動物管理委員會的要求，溫度為(22±2) ℃，相對濕度為23%。實驗前12 h禁食不禁水。

雄性大鼠36只，采用數字表法隨機分為9組，每組4只。9個組分別為給藥前組、給藥后0.5、1、3、6、10、24、48、72 h組，給藥前組不給予百草枯，直接處死取組織；給藥后組單次灌胃給予90 mg/kg百草枯，分別于對應時間點處死大鼠，處死前取血漿，處死后分別取心、肝、肺、腎、大腦、小腦、胃組織。每個時間點各組織用0.9%(質量分數)氯化鈉注射液洗凈，放入-70 ℃冰箱中冰凍待處理。

大鼠處死前通過眼眶取血約0.4 mL，置于含肝素的EP管中，立即以13 200 r/min離心10 min分離血漿，放入-70 ℃冰箱中冰凍待測。

1.5 組織樣本處理方法

剪取并稱量組織(0.250±0.025)g，若組織少于0.25 g，全部取用，記錄全部重量。注意取組織不同部位各一小部分，例如，不同肝葉、雙腎等。加入500 μL乙腈-水(1∶1)，使用勻漿機勻漿2～8 min(根據實際需要，不同組織勻漿時間可適當調整)，組織勻漿液渦流振蕩20 min，在4 ℃下13 200 r/min離心5 min，組織勻漿上清液倒入另一1.5 mL EP管中，-70 ℃冰凍待測。

向1.5 mL EP管中加入組織勻漿上清液樣本100 μL，加入內標溶液100 μL，加入乙腈200 μL，渦流2 min后在4 ℃下13 200 r/min離心10 min，取150 μL上清液進行LC-MS/MS分析，進樣10 μL。

1.6 各組織和血漿中百草枯濃度LC-MS/MS測定方法

本研究前期建立了血漿中百草枯濃度的定量檢測方法，并按照9012《生物樣品定量分析方法指導原則》[10]進行全面方法學驗證，驗證通過后采用建立的方法進行大鼠不同劑量染毒后毒代動力學研究[11]。除基質不同外，7種組織提取液的樣本前處理方法、液相條件、質譜參數與血漿檢測質譜方法完全相同。組織樣本檢測時標準曲線、質控樣本均采用對應空白組織勻漿提取液配制，與組織樣本完全一致。研究中僅對每種組織樣本進行了部分方法學驗證，分別進行了連續(xù)2 d、每天4個濃度水平質控樣品的準確度和精密度考察。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 質控樣品準確度與精密度

所有質控樣品準確度為88.03%～112.73%，精密度為10.14%，方法的準確度和精密度達到生物樣品分析要求。

2.2 大鼠基本情況

大鼠灌胃百草枯染毒后出現活動明顯減少，毛發(fā)易脫落，飲水、飲食減少等現象。大鼠灌胃百草枯染毒后體質量隨時間降低明顯，72 h處置組體質量降幅最大，降幅為給藥前體質量的13.21%。除按處置時間處死取樣外，36只大鼠均無染毒死亡現象。

2.3 組織分布結果

大鼠灌胃百草枯染毒后組織，其中胃、腎、肺和肝的達峰質量濃度均>30 μg/g，心、大腦和小腦的達峰質量濃度均<10 μg/g。胃和肺1 h濃度最高，分別為(205.5±69.5)μg/g、(35.5±28.0)μg/g；腎和肝3 h濃度最高，分別為(124.8±146.9)μg/g、(30.9±42.1)μg/g。各組織和血漿大多數濃度點個體間變異超過50%，呈現較高的個體差異，詳見表2。不同組織是同一時間點濃度差異的影響因素(P<0.01)，除肝、腎、大腦和小腦外，不同時間是同一組織濃度差異的影響因素(P<0.05)。同一組織或同一時間內兩兩比較，大多數組織間比較或時間點間比較均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Tissue and plasmaSampling times/h0.513610244872F2P2Stomach/(μg·g-1)198.3±42.3205.5±69.5150.2±77.641.5±8.231.1±10.830.6±16.56.0±2.02.4±1.218.31< 0.001Kidney/(ng·g-1)54.1±12.843.8±11.8124.8±146.919.6±8.717.9±5.620.4±10.39.0±6.93.6±3.12.250.065Lung/(ng·g-1)29.4±20.335.5±28.013.4±12.510.1±7.89.1±2.79.2±1.56.1±4.54.9±1.62.850.026Liver/(ng·g-1)17.1±9.911.1±5.630.9±42.110.1±6.83.7±1.05.9±4.71.9±0.80.8±0.31.620.179Plasma/(ng·g-1)10.41±10.083.41±1.142.07±1.061.54±1.581.34±1.600.93±0.650.47±0.300.11±0.073.290.01Heart/(μg·g-1)8.8±2.68.7±3.87.5±5.13.7±1.72.8±1.24.7±1.32.9±2.12.2±1.04.160.004Brain/(μg·g-1)5.3±7.21.5±0.91.3±1.70.5±0.21.2±0.72.4±2.40.3±0.10.9±0.41.330.279Cerebellum/(μg·g-1)0.8±1.01.6±0.71.3±0.81.2±0.41.5±1.01.2±0.31.2±0.21.8±0.40.890.532F156.75629.1094.41126.97023.8908.8803.8804.360--P1< 0.001< 0.0010.002< 0.001< 0.001< 0.0010.0060.004--

F1,P1: repeated measures ANOVA;F2,P2: one way ANOVA.

大鼠百草枯染毒后組織及血漿濃度柱狀分布見圖1，濃度-時間曲線見圖2，百草枯在大鼠胃中分布的濃度是在各個臟器中最高的，達峰較快。大鼠的腎、肺和肝也是百草枯分布較多的臟器，其中腎臟中的濃度高于肺中的濃度，但達峰時間比肺慢。百草枯在腎臟中濃度較高，急性腎損傷也是百草枯中毒后常見癥狀。心臟、大腦和小腦中百草枯也有一定分布，濃度最大值為1.6～8.8 μg/g，且大腦中分布較快、心臟排出緩慢。百草枯體內分布狀況與其中毒后靶器官損傷部位及程度高度一致，除大腦48 h外，7種組織24～72 h中組織質量濃度均大于血漿毒物濃度，其中胃、腎、肺和肝中百草枯的質量濃度遠高于血漿濃度。

圖1 大鼠百草枯染毒后組織及血漿濃度圖Fig.1 Tissue and plasma concentration in rats exposed to paraquatA：higher peak mass concentration；B：lower peak mass concentration.

圖2 大鼠百草枯染毒后組織及血漿毒物濃度-時間曲線Fig.2 Concentration-time profile of tissue and plasma concentration in rats exposed to paraquat

3 討論

毒物組織分布研究的前提是建立精準的目標物定量方法，百草枯的質譜定量在離子對和色譜柱的選擇上均需要深入探索和優(yōu)化。百草枯為季胺鹽，本身帶兩個電荷，質譜中最常見的準分子離子峰為m/z93.1，但在轉移過程或離子源中，也可能失去一個電荷，準分子離子峰為186.1，經碰撞后失去一個CH3+形成子離子m/z171.2。百草枯的極性很強，在普通的C18柱子上無法或很難保留，本研究選用的Acclaim trinity Q1色譜柱是專用于高極性化合物的百草枯專用色譜柱，在百草枯的分離和峰形上有便優(yōu)異的效果。樣本測試中百草枯組織濃度極高，超過定量上限的組織樣本需經空白組織提取液稀釋后進行復測。在勻漿過程中要多次逐級清洗勻漿機，防止交叉污染；先勻漿所有空白樣本，根據百草枯體內濃度特點，組織勻漿按時間點“后前”順序勻漿；高濃度的肝、肺、腎、胃組織最后勻漿。

毒性研究應盡可能采用與臨床相同的給予途徑和劑型，以便比較不同種屬動物的全身暴露情況。由于百草枯是易中毒毒物，臨床實踐中無給藥途徑，實際急救中中毒患者均為一次性口服誤入、皮膚黏染、肺吸入，以口服誤入為最常見，且百草枯口服誤入中毒幾乎很少有多次染毒情況，因此本研究選用最常見的一次性灌胃給予毒物。我國自2016年7月1日停止百草枯水劑在國內銷售和使用[12]，臨床上中毒多數為百草枯膠劑或膠劑稀釋液中毒，本研究中使用百草枯膠劑稀釋至所需濃度后灌胃給予大鼠。大鼠急性給予百草枯半數致死量(median lethal dose, LD50)為150 mg/kg，研究選用90 mg/kg劑量進行試驗。

本研究中除按處置時間處死取樣外，36只大鼠均無染毒死亡現象，與本研究室開展的大鼠體內的百草枯毒代動力學研究90 mg/kg劑量下病死率有極大的差異[6]，推測由于藥代動力學研究中需要在給予毒物當天密集采血11個，造成大鼠失血較多，引起高于百草枯LD50的病死率。百草枯大量口服誤入可于24 h內迅速出現肺水腫和肺出血，嚴重者可由此致死，百草枯中毒后全身中毒征象波及多器官系統(tǒng)，大多呈漸進式發(fā)展，約1～3 d內肺、腎、肝、心臟及腎上腺等器官發(fā)生壞死，后續(xù)再進展而亡[13-14]。本研究采集組織樣本最長至72 h，漸進式發(fā)展至死亡72 h內還未有發(fā)生，72 h內未死亡并不能說明病死率較低，針對百草枯病死率的研究需要更長的觀察時間(28 d)。

百草枯在大鼠胃中濃度最高的，達峰較快，與臨床早期癥狀一致(惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉及血便等)，百草枯臨床中毒后第一時間催吐可能能有效降低體內吸收總量，利于愈后和生存率，同時，及時清理口腔毒物，補液利尿，促進毒物排泄。肺是百草枯損傷的主要靶器官，百草枯入肺較快、排出緩慢，大鼠72 h時肺組織中質量濃度比其他組織均高，百草枯中毒患者的死因大多數為肺部不可逆的纖維化損傷和呼吸窘迫綜合征。大腦和小腦由于濃度較低、排出體外較慢等原因，不同時間點濃度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，百草枯中毒患者在中毒至死亡的時間內，神志保持清醒，身體外觀無明顯的不適，這也是百草枯成為讓人聞之色變的毒物原因之一。百草枯在各組織中有蓄積、排出緩慢，血漿質量濃度僅能間接反映百草枯體內情況，并不能代表受損傷器官毒物水平，臨床上應對癥和支持治療，特別應注意處理好呼吸窘迫綜合征、肝壞死和急性腎衰竭等威脅生命的毒效應。通過血液灌流可以祛除血液中的毒物成分，從而減輕或解除毒物對器官的損害。百草枯體內呈現極大的組織間濃度差異和個體差異，應針對每個病例，個性化精準診斷和救治。