大黃酚對局灶性腦缺血再灌注小鼠Beclin1及Bax的作用

房亞蘭 黃語悠 趙詠梅* 師文娟 李錦程 段云霞 高 利 羅玉敏

(1. 北京市平谷區(qū)醫(yī)院全科醫(yī)療科，北京 101200；2. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053)

卒中是世界范圍內(nèi)死亡和殘疾的主要原因，嚴(yán)重危害人類健康，缺血性卒中是最常見的卒中形式，約占所有卒中的80%[1]。雖然在血管再通方面取得了一定進(jìn)展，但靜脈注射重組組織纖溶酶原激活劑實現(xiàn)血管再通受到治療時間窗的限制[2]，并且缺血后血液供應(yīng)的恢復(fù)可導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷，即腦缺血再灌注(I/R)損傷，其病理生理機(jī)制非常復(fù)雜[3]。

腦缺血再灌注導(dǎo)致許多應(yīng)激因子的產(chǎn)生和激活，這些因子觸發(fā)并增強(qiáng)自噬及細(xì)胞凋亡。自噬是對異常的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器進(jìn)行降解及再循環(huán)，以避免老化蛋白質(zhì)或受損細(xì)胞器的積累，從而實現(xiàn)各種細(xì)胞成分的更新[4]。因此，生理狀態(tài)下，適當(dāng)?shù)淖允删哂屑?xì)胞保護(hù)作用，在營養(yǎng)缺乏的條件下促進(jìn)細(xì)胞存活。但腦缺血再灌注時，自噬被過度激活，則引起神經(jīng)細(xì)胞死亡[5]。有研究[6]表明，抑制自噬可減少氧糖剝奪條件下的神經(jīng)元死亡。Beclin1蛋白在自噬的起始階段發(fā)揮重要作用[7]，目前認(rèn)為自噬是不同于壞死和凋亡的生理過程，是卒中后第三種類型的細(xì)胞死亡[8]。近年來的研究[5, 8]表明，神經(jīng)元自噬與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡亦是腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的重要途徑之一，Bax蛋白作為細(xì)胞凋亡家族的重要組成成員，與Beclin1共同參與細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)控[9-10]。

大黃酚(chrysophanol, CHR)是中藥大黃的一種有效提取成分[11]，具有減少炎性因子、抑制氧化應(yīng)激、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等作用[12-14]。一些研究[11-14]表明，在腦缺血再灌注損傷中，CHR具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，但其相關(guān)作用機(jī)制尚不完全清楚。因此，本研究用小鼠制作大腦中動脈梗死(middle cerebral artery occlusion, MCAO)再灌注模型，探究CHR對腦缺血再灌注小鼠再灌注后14 d自噬和細(xì)胞凋亡的影響，為CHR發(fā)揮腦缺血再灌注損傷的長期腦保護(hù)作用機(jī)制提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

2月齡C57BL/B6健康雄性小鼠18只，購自北京維通利華實驗動物公司，實驗動物許可證號：SCXK(京) 2012-0001，體質(zhì)量(23.5±1)g，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院SPF級動物實驗室。采用數(shù)字表法將實驗小鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham，n=6)；缺血再灌注組(MCAO，n=6)；大黃酚給藥組(CHR，n=6)。CHR溶于含1%(體積分?jǐn)?shù))Tween 80和1%(體積分?jǐn)?shù))DMSO的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中，自缺血再灌注模型制作當(dāng)天至再灌注后14 d，連續(xù)每天予以CHR組小鼠腹腔注射0.1 mg/kg CHR， Sham組和MCAO組小鼠腹腔注射同等體積的含1%(體積分?jǐn)?shù)) Tween 80和1%(體積分?jǐn)?shù))DMSO的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。

1.2 主要儀器設(shè)備與試劑

小動物手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、雙極電凝器(ACC100，德威公司)、麻醉機(jī)(Harvard Apparatus公司，美國)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(CMA 150 ，Carnegie Medicin公司，瑞典)、離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司,美國)、熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)等。

CHR(中國食品藥品檢定研究院)；Tween 80(Sigma公司，美國)；恩氟烷(河北一品制藥有限公司)；Beclin1抗體(Abcam公司，美國)；Bax抗體(CST公司，美國)；NeuN抗體(Millipore公司，美國)；β-actin抗體(Santa公司，美國)等。

1.3 動物模型制作

參照改良ZeaLonga法[15]制作小鼠MCAO模型。將恩氟烷混合于70%(體積分?jǐn)?shù))N2O和30%(體積分?jǐn)?shù))O2，用5%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷對實驗小鼠進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，再用2%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷維持麻醉。自小鼠頸部正中切口分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，將尼龍線栓(頭端直徑為0.38 mm)自頸外動脈殘端插入頸內(nèi)動脈，至距頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉約1 cm處。手術(shù)操作過程中應(yīng)用反饋性控溫毯監(jiān)測實驗小鼠肛溫，維持在(37.0±0.5) ℃。栓塞45 min后，拔出線栓進(jìn)行再灌注。術(shù)后小鼠自由進(jìn)食及飲水，并飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室。

1.4 免疫熒光雙標(biāo)染色

于缺血再灌注模型制作后的第14天，所有小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，斷頭取腦，置于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛后固定48 h，再經(jīng)30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖脫水24 h后，將腦組織制作連續(xù)冰凍切片，每片腦組織厚度均為20 μm，腦組織切片用PBS清洗后，于含有0.2%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100的PBS中室溫下孵育10 min，用PBS清洗后，于5 %(體積分?jǐn)?shù))山羊血清中室溫下封閉30 min，滴加一抗(Beclin1與NeuN鼠多克隆抗體 1∶300)，4 ℃過夜。次日將腦組織切片用PBS清洗后，滴加山羊抗鼠和山羊抗兔熒光二抗(1∶300)，室溫避光孵育1 h。PBS清洗后，用DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)封片劑封片。置于熒光顯微鏡下觀察。每組小鼠選擇同一位置的腦切片3張，在相同放大倍數(shù)、相同參數(shù)條件下，每張腦組織冰凍切片隨機(jī)選取4個腦皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)視野照相，使用NIS Element軟件統(tǒng)計。

1.5 Western blotting

于缺血再灌注模型制作后的第14天，所有實驗小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后斷頭取腦，立即置于模具中，于前囟0到-0.1切取厚度1 mm的冠狀腦組織切片，在冰上將缺血梗死側(cè)腦組織置于含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中勻漿，冰浴30 min后，經(jīng)4 ℃ 12 000g離心30 min后取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度。樣品中加入上樣緩沖液煮沸10 min，然后行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜90 min，于室溫下5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶中封閉1 h，將膜置入一抗(Bax 1∶1 000，β-actin 1∶1 000)，于4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST清洗3次，于室溫下HRP標(biāo)記的二抗中孵育1 h，經(jīng)TBST清洗3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，于化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測，蛋白條帶用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CHR抑制MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1表達(dá)

免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果可見，在MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)內(nèi)可見Beclin1陽性細(xì)胞為紅色熒光染色、NeuN陽性細(xì)胞為綠色熒光染色，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光。圖像合并后，Beclin1紅色熒光與NeuN綠色熒光重合，表明Beclin1與神經(jīng)元共定位，即腦缺血再灌注后Beclin1在缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)(圖1A)。結(jié)果還顯示，Sham組小鼠腦組織內(nèi)偶見Beclin1紅色熒光染色；與Sham組相比，MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1染色陽性細(xì)胞顯著增多(P<0.05)；與MCAO組相比，CHR組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1的表達(dá)顯著減少(圖1A)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

2.2 CHR抑制MCAO小鼠缺血側(cè)腦組織Bax蛋白的表達(dá)

如圖2所示，缺血45 min再灌注后第14天，MCAO組小鼠缺血側(cè)腦組織的Bax蛋白表達(dá)水平比Sham組明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與MCAO組相比，CHR組小鼠缺血側(cè)腦組織Bax蛋白表達(dá)水平明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測腦缺血再灌注后14 d Sham、MCAO與CHR組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1與NeuN的表達(dá) Fig.1 Expression of Beclin1 (red) and NeuN (green) in cerebral ischemia penumbra of Sham, MCAO and CHR groups mice 14 d after reperfusion by double immunofluorescence labeling

A：representative double immunofluorescence labeling of Beclin1 (red) / NeuN (green) on 14 d after ischemia/reperfusion. Bar=20μm.B: quantification of Beclin1-positive cells. (n=5, mean±SD)*P<0.05vsSham group,#P<0.05vsMCAO group;MCAO: middle cerebral artery occlusion;DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole;CHR: chrysophanol.

圖2 蛋白免疫印跡法檢測腦缺血再灌注后14 d Sham、MCAO及CHR組小鼠缺血側(cè)腦組織促凋亡蛋白Bax的表達(dá)Fig.2 Expression of Bax in ischemia brain tissue of Sham, MCAO and CHR groups mice 14 d after reperfusion by Western blotting

*P<0.05vsSham group,#P<0.05vsMCAO group (n=5, mean±SD);MCAO: middle cerebral artery occlusion;CHR: chrysophanol.

3 討論

腦缺血再灌注損傷涉及炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等許多復(fù)雜的病理生理過程，自噬和凋亡亦是腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)，這些因素相互作用，最終引起神經(jīng)元死亡[3]。筆者前期的研究[13-14,16]顯示，經(jīng)HE染色小鼠腦組織切片，發(fā)現(xiàn)MCAO小鼠的缺血側(cè)腦組織丟失面積顯著增加，CHR能顯著減少小鼠缺血側(cè)腦組織丟失面積，降低轉(zhuǎn)棒試驗、平衡木實驗等神經(jīng)功能評分，并能夠有效抑制腦缺血再灌注后的炎性因子、減少活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，顯著提高M(jìn)CAO小鼠再灌注后14 d的生存率，具有長期的腦保護(hù)作用。但是關(guān)于CHR對自噬和細(xì)胞凋亡的影響仍不明確，對此環(huán)節(jié)的深入研究或許可為CHR減輕腦缺血再灌注損傷的機(jī)制提供更多的科學(xué)依據(jù)。Beclin1目前被認(rèn)為是自噬的重要標(biāo)志蛋白[7]。Bax作為細(xì)胞凋亡領(lǐng)域的研究熱點之一，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[17]。本研究采用MCAO模型小鼠，應(yīng)用免疫熒光染色法檢測腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1蛋白的水平，Western blotting方法檢測缺血側(cè)腦組織Bax蛋白的表達(dá)水平，探究CHR在腦缺血再灌注過程中對于神經(jīng)元自噬及凋亡的影響，從而進(jìn)一步明確CHR發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。

近幾年的研究[4,18]表明，自噬是細(xì)胞經(jīng)由溶酶體途徑對細(xì)胞內(nèi)功能失調(diào)的細(xì)胞器和異常的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解和再利用的過程，對于自體修復(fù)具有重要意義，適度的自噬有助于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。但是在特定條件下，自噬被過度激活則會引起自噬性細(xì)胞死亡[18-19]，研究[5-6,8]表明，自噬在I / R損傷中扮演極其重要的角色。Beclin1參與自噬體膜的形成，在自噬的起始階段具有重要作用，其表達(dá)水平與自噬活性密切相關(guān)[7,20-21]。為了探究CHR對腦缺血再灌注后自噬的影響，本研究檢測了CHR對MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)自噬相關(guān)蛋白Beclin1的影響。研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注后14 d，與Sham組相比，MCAO組小鼠腦缺血半暗帶區(qū)的Beclin1蛋白水平明顯增多。Beclin1調(diào)控其他自噬蛋白到自噬前體中，在自噬過程中發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用[20]。敲除Beclin1可通過抑制自噬減輕腦缺血后神經(jīng)變性[19]。因此本研究表明，腦缺血再灌注后可誘導(dǎo)Beclin1蛋白過量產(chǎn)生，進(jìn)而過度激活自噬。通過將Beclin1與NeuN進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，自噬相關(guān)蛋白Beclin1與神經(jīng)元共定位，提示腦缺血再灌注后神經(jīng)元發(fā)生自噬性死亡可能是腦損傷的主要原因之一。予以CHR治療的MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1蛋白水平明顯下降，表明CHR可能通過減少Beclin1產(chǎn)生，進(jìn)而抑制過度自噬，減少神經(jīng)元自噬性死亡，發(fā)揮長期腦保護(hù)作用。

Beclin1是協(xié)調(diào)細(xì)胞自噬與凋亡的重要蛋白質(zhì)[9,21]。新的研究[8]表明，自噬和細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的主要形式。自噬與凋亡相互作用，可加重細(xì)胞受損，增加細(xì)胞死亡[22-23]。Bcl-2家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的主要途徑，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2家族的重要組成成員[24]。關(guān)于心肌缺血再灌注的研究[25-26]顯示，Bcl-2與Beclin1相互作用可調(diào)節(jié)自噬程度，抑制過度自噬誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。有關(guān)食管癌的臨床研究[27-28]顯示，Beclin1蛋白表達(dá)與Bax水平呈正相關(guān)，Bax蛋白高表達(dá)在高分化食管鱗癌中可抑制Bcl-2對于Beclin1的調(diào)節(jié)，促進(jìn)Beclin1介導(dǎo)的細(xì)胞自噬性死亡。經(jīng)高濃度半胱氨酸蛋白酶抑制劑C處理的腦缺血再灌注大鼠，缺血側(cè)腦皮質(zhì)內(nèi)的促凋亡蛋白Bax與自噬蛋白Beclin1過量表達(dá)，進(jìn)一步的相關(guān)性分析表明，缺血側(cè)腦皮質(zhì)內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)與Beclin1呈正相關(guān)[10]。然而，目前對于Beclin1與Bax在腦缺血再灌注損傷中具體的相互作用關(guān)系尚不明確。本研究提示，Beclin1與Bax可能存在相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與凋亡。因此，本研究進(jìn)一步探究了CHR對MCAO小鼠缺血側(cè)腦組織Bax蛋白水平的影響，結(jié)果顯示，腦缺血再灌注后14 d，MCAO組小鼠缺血側(cè)腦組織Bax蛋白水平較Sham組小鼠明顯升高，表明腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax大量表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡。給予CHR治療的MCAO小鼠缺血側(cè)腦組織Bax蛋白水平較MCAO組小鼠明顯降低，說明CHR可減少Bax蛋白產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)合本研究中CHR減少MCAO小鼠腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1表達(dá)，提示CHR可能通過減少Bax促凋亡蛋白表達(dá)，抑制Beclin1介導(dǎo)的神經(jīng)元自噬性死亡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，給予CHR治療可抑制促凋亡蛋白Bax產(chǎn)生，下調(diào)自噬蛋白Beclin1的表達(dá)，進(jìn)而抑制腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡和自噬，減少神經(jīng)元死亡，發(fā)揮長期神經(jīng)保護(hù)作用。