敲減NEDD1表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞增殖與遷移*

郭君琪， 楊 赟， 張瀅泉， 李春橋， 王浛睿， 孔麗君， 胡金霞

(濱州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 山東 煙臺(tái) 264003)

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，每年約有160萬人死于肺癌[1]。所有肺癌患者中大約85%為非小細(xì)胞肺癌，其中肺腺癌和肺鱗癌是最常見的亞型[2-3]。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 1，NEDD1)基因定位于染色體12q22，是最早在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的發(fā)育調(diào)控基因，編碼一種由660個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)[4]，其N末端為7個(gè)WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域(WD40 repeat domain)，該結(jié)構(gòu)域通常被視為可與其它蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的區(qū)域。多種含WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白被報(bào)道與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5]，對(duì)NEDD1的研究目前主要集中于其在胚胎發(fā)育和細(xì)胞有絲分裂中的生物學(xué)功能和調(diào)控方面，而NEDD1與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究較少。我們前期分析腫瘤公共數(shù)據(jù)庫資料發(fā)現(xiàn)NEDD1在肺癌和癌旁組織中的表達(dá)有差異性，因此本文擬對(duì)肺癌組織標(biāo)本中NEDD1的表達(dá)情況進(jìn)行初步檢測(cè)，以非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)合細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)庫資料分析，明確NEDD1表達(dá)與肺癌的關(guān)系，并探討其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

材 料 和 方 法

1 組織標(biāo)本的收集與細(xì)胞培養(yǎng)

收集煙臺(tái)山醫(yī)院15例肺癌患者(男7例，女8例)手術(shù)切除的腫瘤組織及配對(duì)癌旁正常組織，并固定切片備用。肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自上海中科院細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗人NEDD1抗體(13993-1-AP)購自Proteintech；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(PV-6001/6002)、PBS緩沖液(ZLI-9062)、 EDTA抗原修復(fù)液(ZLI-9067)和DAB顯色試劑盒(ZLI-9018) 購自中杉金橋公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(50 TWLA001b)購自萬類生物科技有限公司；RIPA裂解液(強(qiáng))購自賽爾斯生物技術(shù)有限公司；PageRuler Prestained Protein Ladder購自Thermo Scientific；NEDD1 小干擾RNA(NEDD1 small interfering RNA, si-NEDD1) 5’-GGGCAAAAGCAGACAUGUGTT-3’購自Sigma；Transwell 小室購自BD；細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)蛋白抗體(#9917)購自Cell Signaling Technology。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1免疫組織化學(xué)染色 石蠟包埋組織切片，置于60 ℃烤箱烤2 h，二甲苯溶液常溫脫蠟2次，每次20 min，梯度乙醇充分水化，每梯度5 min，PBS洗3次，每次5 min，3%過氧化氫封閉10 min，使用EDTA抗原修復(fù)液修復(fù)3 min，自然冷卻。4% 山羊血清封閉20 min，滴加 I 抗，濃度為1∶100，4 ℃孵育過夜。次日室溫復(fù)溫30 min，PBS洗 3次，每次5 min，滴加 II 抗，室溫孵育 30 min，滴加DAB觀察染色情況，蘇木精染核，鹽酸乙醇分化，流水返藍(lán)15 min，中性樹脂封片，室溫下顯微鏡觀察。

3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)到次日細(xì)胞約30%～40%融合，分別轉(zhuǎn)染si-NEDD1(實(shí)驗(yàn)組)及空白對(duì)照小干擾RNA(control siRNA, si-Con)(對(duì)照組)，48 h后PBS洗滌1次，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌 1 次，加500 μL緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 混勻,加入5 μL Propidium Iodide， 1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集細(xì)胞，PBS 漂洗后，用1 mL 70% 的乙醇重懸，-20 ℃固定過夜，次日1 500 r/min離心 5 min沉淀細(xì)胞，用預(yù)冷PBS 漂洗后，加入100 μL RNA酶重懸，37 ℃水浴30 min， 加400 μL Propidium Iodide染色液混勻，4 ℃避光30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.4平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按每培養(yǎng)皿約1 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)2周后去掉上層培養(yǎng)基，PBS洗滌， 4%的多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，結(jié)晶紫染色10 min，流水沖洗，干燥。

3.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA試劑裂解細(xì)胞30 min，期間每10 min搖勻1次。加入loading buffer后95 ℃煮蛋白變性 10 min, 4 ℃ 冷卻，待用。行10%的 SDS-PAGE分離蛋白，200 mA，90 min 恒流轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜，用含 5% BSA的 TBST室溫封閉2 h。加入 I抗4 ℃孵育過夜；次日TBST 洗膜3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG 4 ℃孵育2 h。洗膜3 次，每次15 min，ECL曝光成像。 數(shù)據(jù)用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參照。

3.6Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力 將Transwell小室放入24孔板中，上層分別加入純RPMI-1640培養(yǎng)基重懸的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞各100 μL，濃度約為108/L，小室下層加600 μL 含20% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)基，每組3個(gè)平行孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)20 h后取出小室，棉簽擦拭上層，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗3 min，觀察并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，兩組間比較滿足正態(tài)分布采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不滿足正太分布采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NEDD1在肺癌組織中表達(dá)升高

為明確NEDD1在肺腺癌組織中的表達(dá)情況，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)了15例肺癌與癌旁正常組織中NEDD1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與正常肺組織相比，肺腺癌組織中NEDD1表達(dá)明顯增多，而正常肺組織則低表達(dá)甚至不表達(dá)，見圖1A；分析TCGA數(shù)據(jù)庫資料也顯示NEDD1在肺腺癌組織中表達(dá)高于正常組織(P<0.01)，見圖1B，說明NEDD1表達(dá)可能與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。進(jìn)一步分析TCGA數(shù)據(jù)庫資料預(yù)后顯示NEDD1低表達(dá)患者預(yù)后良好，而高表達(dá)者預(yù)后較差(P<0.01)，見圖1C，表明NEDD1在肺癌組織中高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)，可以作為肺癌的診斷與預(yù)后指標(biāo)。

Figure 1. The expression of NEDD1 in lung cancer and adjacent normal tissues and its correlation with prognosis. A： the expression of NEDD1 in the lung cancer and adjacent normal tissues; B: the expression of NEDD1 in LUAD from TCGA; C: database analyze showed the effect of NEDD1 expression on the survival of LUAD patients. Mean±SD.**P<0.01vsnormal group;△△P<0.01vslow expression group.

圖1 NEDD1在肺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)及NEDD1表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性分析

2 敲減NEDD1 表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖

為檢測(cè)NEDD1對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長增殖的影響，轉(zhuǎn)染si-NEDD1及si-Con 48 h后，光鏡下觀察細(xì)胞生長，可見實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染si-NEDD1后細(xì)胞增殖速度明顯減低(P<0.01),見圖2A，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小干擾RNA可顯著下調(diào)NEDD1表達(dá)(P<0.01)，見圖2B。平板集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，敲減NEDD1表達(dá)后，A549細(xì)胞的集落形成能力降低(P<0.01)，見圖2C。以上結(jié)果表明敲減NEDD1的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞增殖。

3 敲減NEDD1表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移

細(xì)胞凋亡率的高低可以影響細(xì)胞的增殖速度，為檢測(cè)NEDD1對(duì)細(xì)胞凋亡的作用，將A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Con及si-NEDD1后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的凋亡率為9.4%，實(shí)驗(yàn)組的凋亡率上升至26.5%(P<0.05)，見圖3A。腫瘤細(xì)胞的惡性表型還表現(xiàn)在侵襲轉(zhuǎn)移方面，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低NEDD1表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組遷移至Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，見圖3B，說明敲減NEDD1表達(dá)后A549細(xì)胞的遷移能力減弱。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲減NEDD1表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移。

4 敲減NEDD1表達(dá)阻滯細(xì)胞周期

除影響細(xì)胞凋亡之外，有些具有促癌作用的蛋白質(zhì)還可以通過參與調(diào)控細(xì)胞周期影響細(xì)胞的增殖速度，為明確NEDD1是否能夠影響細(xì)胞周期進(jìn)程，敲低A549細(xì)胞NEDD1表達(dá)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組 G0/G1期的比例(76.96%)較對(duì)照組(61.54%)顯著升高，S期比例卻呈下降趨勢(shì)(P<0.01)，表明A549細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期,見圖4A。為探討相關(guān)機(jī)制我們進(jìn)行了Western blot實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)p-Rb、CDK2和cyclinD1的蛋白水平降低，p-p53、p-Chk1和p-Chk2表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)，且通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌組織中相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)CDK2的表達(dá)與NEDD1呈正相關(guān)(P<0.05)，見圖4B、4C，表明敲減NEDD1表達(dá)可影響細(xì)胞周期進(jìn)程。

Figure 2. Effect of knock-down of NEDD1 expression on the proliferation of A549 cells. A: the cells were observed under inverted microscope after the transfection with si-NEDD1; B: the protein expresssion of NEDD1 after knock-down ofsiNEDD1expression; C: the results of colony formation assay of A549 cells after transfected with si-NEDD1. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-Con group.

圖2 敲減NEDD1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

Figure 3. Effect of knock-down of NEDD1 expression on apoptosis and migration ability of A549 cells. A: flow cytometry analysis was used to test the apoptosis in the A549 cells after transfeced with si-NEDD1; B: the number of migratiing cells after treatment with si-NEDD1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssi-Con group.

圖3 敲減NEDD1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡和遷移能力的影響

Figure 4. Effect of knock-down of NEDD1 expression on cell cycle and related protein levels. A: the results of flow cytometry for analyzing the cell cycle distribution; B: the correlation in gene expression betweenNEDD1andCDK2; C: the representative results of Western blot for determining the related protein levels. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssi-Con group.

圖4 敲減NEDD1表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期及相關(guān)蛋白水平的影響

討 論

NEDD1最初發(fā)現(xiàn)于小鼠的神經(jīng)前體細(xì)胞，同期被發(fā)現(xiàn)的NEDD4和 NEDD9等都被證實(shí)參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。現(xiàn)階段NEDD1的研究主要集中在細(xì)胞有絲分裂過程中紡錘體和中心體形成方面，NEDD1的羧基末端結(jié)構(gòu)域經(jīng)過Cdk1、Pik1和Nek9次序磷酸化后可與γ-tubulin相互作用[6-10]，并將其募集到中心體，與其它蛋白質(zhì)形成一個(gè)大的復(fù)合物，即γ-微管蛋白環(huán)狀復(fù)合體(γ-tubulin ring complex，γ-TuRC)[11-12]，因此NEDD1是中心體微管成核、紡錘體組裝以及中心粒復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞正常有絲分裂起到非常重要的作用。NEDD1的眾多研究都顯示了其在細(xì)胞有絲分裂中的重要作用[13]。

已知，幾乎所有腫瘤的發(fā)生都與細(xì)胞異常分裂有關(guān)，細(xì)胞有絲分裂相關(guān)蛋白異常表達(dá)也是一個(gè)普遍的現(xiàn)象。有研究顯示腹腔注射靶向NEDD1的小干擾RNA，可明顯延長胃癌腹腔轉(zhuǎn)移模型鼠的生存期，提示 NEDD1有可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。本研究發(fā)現(xiàn)NEDD1在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，這與數(shù)據(jù)庫資料的分析結(jié)果一致，并且大數(shù)據(jù)分析結(jié)果還顯示NEDD1低表達(dá)的患者預(yù)后良好，而高表達(dá)者的預(yù)后較差。在接下來的功能研究中，我們發(fā)現(xiàn)NEDD1具有促進(jìn)肺癌細(xì)胞株A549增殖、抑制凋亡，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，并促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用，表明NEDD1有可能作為促腫瘤因子參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展過程，并可能作為肺癌診斷和評(píng)估預(yù)后的新靶標(biāo)。

為揭示NEDD1促進(jìn)A549細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們?cè)谇脺pNEDD1表達(dá)后，檢測(cè)了細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p-Rb和cyclinD1下調(diào)，p-Chk1和p-Chk2升高。同時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)庫中基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌組織中，NEDD1與CDK2的表達(dá)呈現(xiàn)出正相關(guān)。CDK2作為細(xì)胞周期的影響因子能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞生長，使細(xì)胞順利通過G1期，與本研究中敲減NEDD1將肺腺癌細(xì)胞阻滯于G1期結(jié)果一致，提示NEDD1有可能通過調(diào)節(jié)CDK2的表達(dá)影響了細(xì)胞周期進(jìn)程，甚至細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖。p-Chk1和p-Chk2富集于G2期，但在流式細(xì)胞術(shù)中并未表現(xiàn)出G2期的阻滯，除此之外p-Chk1和p-Chk2還可作為ATM/ATR的下游信號(hào)分子參與經(jīng)典的細(xì)胞DNA損傷通路，Inan?等[15]將NEDD1 作為檢測(cè)DNA損傷的參考蛋白，敲減NEDD1表達(dá)后p-Chk1和p-Chk2的蛋白水平升高可能與DNA的損傷有關(guān)，p-P53 升高更加驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

另外，NEDD1的N末端為WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域，折疊成β-螺旋樣結(jié)構(gòu)。同樣含有WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)WDR5可抑制p53泛素化而上調(diào)p53蛋白從而影響肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡[16]，NEDD1同家族的NEDD4和NEDD8都與蛋白質(zhì)泛素化降解途徑有密切關(guān)系[17-20]，NEDD1是否能夠通過調(diào)控p53的泛素化進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡有待于進(jìn)一步的研究，NEDD1是否還與其它蛋白質(zhì)通過WD40結(jié)構(gòu)域相互作用，并參與其它尚未知的腫瘤生物學(xué)行為調(diào)控也是值得關(guān)注的問題。

總之，我們的數(shù)據(jù)表明，干擾NEDD1的表達(dá)可抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞遷移，而其高表達(dá)與肺癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)，因此，NEDD1有可能成為新的肺癌診斷、預(yù)后的標(biāo)記分子及治療的新靶點(diǎn)。