miR-337靶向調(diào)節(jié)p53表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞自噬和遷移能力的影響*

李 磊， 張 秘， 李文濤， 張代娟， 劉江月△

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1解剖學(xué)教研室, 2附屬醫(yī)院， 3機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 4病理生理教研室， 山東 濰坊 261053)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是發(fā)病率和死亡率最高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。近年來，CRC的發(fā)病率和死亡率持續(xù)增高，發(fā)病年齡逐漸年輕化，且預(yù)后差[1-2],因此深入研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制對提高結(jié)腸癌的早期診斷及改善預(yù)后非常重要。自噬是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的一條重要途徑，自噬活性的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，已成為近年來腫瘤發(fā)生機(jī)制、治療和預(yù)后研究的新領(lǐng)域[3]。Beclin-1是參與自噬調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，LC3B是用來檢測和監(jiān)測細(xì)胞自噬過程應(yīng)用最廣泛的標(biāo)志物[4]，p53蛋白是近些年新發(fā)現(xiàn)的能夠抑制細(xì)胞自噬作用的蛋白。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類物種間序列高度保守的單鏈非編碼小RNA，幾乎參與了細(xì)胞增殖、分化和凋亡等各種生命活動(dòng)，對腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有重要的調(diào)控作用[5-6]。本研究通過檢測結(jié)腸癌組織中beclin-1、LC3B和p53蛋白的表達(dá)，分析自噬與臨床特征的相關(guān)性；通過生物信息學(xué)預(yù)測、篩選靶向p53的miRNAs，檢測其對p53基因的調(diào)控作用，并分析其對結(jié)腸癌細(xì)胞自噬和侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1組織標(biāo)本 收集2016年1月～2017年12月濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科保存的59例手術(shù)切除的經(jīng)活檢證實(shí)為結(jié)腸癌且術(shù)前未經(jīng)任何放、化療治療的組織標(biāo)本,其中男38例，女21例；年齡48～79(61.5±3.8)歲；低分化22例，中高分化37例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期25例，Ⅲ+Ⅳ期34例；腸壁浸潤深度T1～T2 24例，T3～T4 35例；有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例。取距離腫瘤位置>5 cm的癌旁黏膜組織標(biāo)本作為對照。所有組織標(biāo)本均采用4%的多聚甲醛固定保存。

1.2細(xì)胞株 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.3主要試劑及儀器 免疫組化和Western blot相關(guān)試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑(Gibco)；抗beclin-1、LC3B和p53 I抗(武漢博士德生物工程有限公司)；雙螢光素酶檢測試劑盒(Promega)。SpectraMax Gemini EM 熒光型酶標(biāo)儀(Molecular Devices)；DYCZ-25D型電泳儀(北京市六一儀器廠)；Bio-Rad 型濕轉(zhuǎn)儀和BioSpectrum AC凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2 方法

2.1免疫組化檢測beclin-1、LC3B和p53蛋白的表達(dá) 固定的標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，明確病理診斷。采用免疫組化 SP 法檢測結(jié)腸癌組織和正常黏膜組織中的beclin-1、LC3B和p53蛋白的表達(dá)，操作步驟按說明書進(jìn)行，PBS代替 I 抗作陰性對照。結(jié)果判定：beclin-1、LC3B和p53均以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞, 使用同機(jī)圖像分析系統(tǒng)，進(jìn)行免疫組化分析，另有一位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行光鏡下分析。根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比判斷：無陽性著色或陽性著色<5%記為0分，陽性著色5%～25%記為1分，著色細(xì)胞25%～50%記為2分，著色細(xì)胞>50%記為3分；根據(jù)顆粒著色強(qiáng)度進(jìn)行判斷：不染色記為0分，顆粒淺棕色記為1分，顆粒棕色記為2分，顆粒深棕色記為3分;兩者乘積0分為陰性，1～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6～9分為強(qiáng)陽性(+++)。陽性率(%)=(弱陽性例數(shù)+陽性例數(shù)+強(qiáng)陽性例數(shù))/總例數(shù)×100%。

2.2透射電鏡觀察結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞中自噬小體的形成 常規(guī)培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞分為正常對照(control)組和p53基因敲減(p53 siRNA)組(轉(zhuǎn)染p53基因的siRNA以敲減p53基因的表達(dá)水平)。收集細(xì)胞，用3%戊二醛固定過夜，1%鋨酸固定2 h，脫水，純包埋液37 ℃包埋2～3 h，固化，超薄切片機(jī)切片70 nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體。

2.3Western blot檢測HCT116細(xì)胞beclin-1和LC3B蛋白的表達(dá) 細(xì)胞處理同電鏡實(shí)驗(yàn)，提取總蛋白，SDS-PAGE后切取目的條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入 I 抗(1∶500)4 ℃過夜，TBST漂洗3次，II 抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影定影，圖像分析。

2.4螢光素酶報(bào)告基因檢測 常規(guī)培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞分別以miRNA-NC+psiCHECK-2 vector、miRNA-NC+psiCHECK-2-p53 3’-UTR、miR-337+psiCHECK-2 vector及miR-337+psiCHECK-2-p53 3’-UTR進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后利用螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒進(jìn)行檢測，具體操作按說明書進(jìn)行，檢測miR-337對p53基因3’-UTR相互作用的位點(diǎn)和功能。

2.5RT-qPCR方法檢測miR-337在HCT116細(xì)胞中的表達(dá) 常規(guī)培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞分為正常對照(control)組和過表達(dá)miR-337組(過表達(dá)miR-337的慢病毒轉(zhuǎn)染)，收集細(xì)胞，提取總RNA后合成cDNA，GAPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。

2.6Western blot檢測p53、beclin-1和LC3B的表達(dá) 細(xì)胞處理同RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，收集細(xì)胞，提取總蛋白，檢測p53、beclin-1和LC3B的表達(dá)，方法同上。

2.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測HCT116細(xì)胞的遷移能力 細(xì)胞處理同RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，將生長良好的HCT116細(xì)胞調(diào)整密度為5×108/L。取100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室中，下室加入600 μL含20% FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，拿出小室，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS 漂洗3次，去除濾膜上層細(xì)胞后，鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)；兩指標(biāo)相關(guān)性采用Spearman秩檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 結(jié)腸癌組織中beclin-1和LC3B蛋白的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)腸癌組織中beclin-1和LC3B蛋白的陽性表達(dá)率分別為27.1%和32.2%，癌旁黏膜組織中分別為91.5%和86.4%，結(jié)腸癌組織中beclin-1和LC3B 蛋白陽性表達(dá)率低于癌旁黏膜組織(P<0.05)，見圖1、表1。低分化、Ⅲ+Ⅳ期、腸壁浸潤深度T3～T4及有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織中beclin-1和LC3B 陽性表達(dá)率低于中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、腸壁浸潤深度T1～T2及無遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織(P<0.05)，結(jié)腸癌組織中beclin-1和LC3B 陽性表達(dá)率與性別和年齡無關(guān)(P>0.05)，提示結(jié)腸癌組織中自噬活性減弱，與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，見表2。

Figure 1. The protein expression of beclin-1 and LC3B in adjacent colonic mucosa and colon cancer tissues (×200).

圖1 Beclin-1和LC3B蛋白在癌旁黏膜組織和結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

表1 Beclin-1和LC3B蛋白在結(jié)腸癌和癌旁黏膜組織中表達(dá)的比較

2 結(jié)腸癌組織中p53蛋白的表達(dá)及與beclin-1和LC3B蛋白的關(guān)系

結(jié)腸癌組織中p53蛋白陽性表達(dá)率為72.9%，顯著高于癌旁黏膜組織(20.3%)(P<0.05),見圖2。p53蛋白的表達(dá)與beclin-1和LC3B蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.828，r=-0.771，P<0.05)，提示p53蛋白負(fù)調(diào)節(jié)自噬活性。

3 敲減p53基因的表達(dá)對HCT116細(xì)胞中自噬小體形成的影響

轉(zhuǎn)染靶向p53基因的siRNA敲減p53基因表達(dá)后，HCT116細(xì)胞中自噬小體形成明顯增多,見圖3。

4 敲減p53基因的表達(dá)對HCT116細(xì)胞中beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染靶向p53基因的siRNA敲減p53基因表達(dá)后，細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1和LC3B表達(dá)明顯升高(P<0.05)，證實(shí)p53基因能夠負(fù)調(diào)節(jié)自噬活性，見圖4。

5 miR-337在HCT116細(xì)胞中的表達(dá)

我們通過TargetScan軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)p53基因有miR-337的結(jié)合位點(diǎn)，miR-337在p53基因mRNA的3’-UTR的作用位點(diǎn)預(yù)測見表3。RT-qPCR檢測到miR-337在HCT116細(xì)胞中有表達(dá)，見圖5。

表2 結(jié)腸癌組織中beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Figure 2. The expression of p53 protein in adjacent colonic mucosa and colon cancer tissues (×200).

圖2 p53蛋白在癌旁黏膜和結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

Figure 3. The effect ofp53gene expression knock-down on autophagosome formation in the HCT116 cells (×8 000).

圖3 敲減p53基因的表達(dá)對HCT116細(xì)胞中自噬小體形成的影響

Figure 4. The protein expression of beclin-1 and LC3B in the HCT116 cells with knock-down ofp53gene expression. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group.

圖4 敲減p53基因的表達(dá)對HCT116細(xì)胞中beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)的影響

6 miR-337對p53基因的靶向調(diào)節(jié)作用

通過螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證 miR-337靶向調(diào)節(jié)p53基因的情況，與miRNA-NC+psiCHECK-2 vector共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，miR-337+psiCHECK-2 vector

表3 TargetScan預(yù)測miR-337靶向結(jié)合p53基因3’-UTR的結(jié)合位點(diǎn)

Table 3. TargetScan predicted the binding site of miR-337 on the 3’-UTR ofp53gene 共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其螢光素酶表達(dá)活性沒有變化，而在miR-337+psiCHECK-2-p53 3’-UTR共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，螢光素酶表達(dá)活性顯著降低(P<0.05)，見圖6。

Predicted consequen-tial pairing of target region and miRNASeed matchp53 3’-UTR3’-ggucgauuguuAUGUGACGGc-5’ miR-3375’-acaaccaauuuUACACUGCCu-3’

Figure 5. The expression of miR-337 in the HCT116 cells.

圖5 miR-337在HCT116細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 6. Luciferase reporter assay of miR-337/miRNA-NC+psiCHECK-2-p53 3’-UTR/psiCHECK-2 vector in colon cancer HCT116 cells. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsmiR-337+psiCHECK-2 vector group.

圖6 螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

7 過表達(dá)miR-337對HCT116細(xì)胞p53、beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)的影響

用過表達(dá)miR-337的慢病毒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，p53蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，自噬相關(guān)蛋白beclin-1和LC3B表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見圖7。

Figure 7. The effect of miR-337 over-expression on the protein expression of p53, beclin-1 and LC3B in the HCT116 cells. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group.

圖7 過表達(dá)miR-337對HCT116細(xì)胞p53、beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)的影響

8 過表達(dá)miR-337對HCT116細(xì)胞遷移能力的影響

用過表達(dá)miR-337的慢病毒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，遷移至下室的細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著減少(P<0.05)，見圖8。

討 論

結(jié)腸癌是我國發(fā)病率逐年升高的惡性腫瘤之一,男女發(fā)病比率約為1.4～2.5∶1[7]，本研究中，入組的標(biāo)本男女比率大約為1.8，符合流性病學(xué)發(fā)病特點(diǎn)。隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，對結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的研究也更加深入，但其發(fā)生機(jī)制目前尚不明確。

目前研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤中均存在自噬活性的改變，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，beclin-1和LC3B蛋白在宮頸鱗癌組織、乳腺癌組織及肺癌組織中的表達(dá)均顯著低于相應(yīng)正常組織中的表達(dá)[8-10]，本研究結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中beclin-1和LC3B 蛋白陽性表達(dá)率顯著低于癌旁正常黏膜組織，提示結(jié)腸癌組織中自噬活性減弱，與前人的研究結(jié)果一致。自噬活性減弱可能導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，利于細(xì)胞突變和腫瘤細(xì)胞的發(fā)生，同時(shí)在腫瘤生長早期，腫瘤細(xì)胞的迅速大量繁殖需要蛋白合成，而自噬的作用是降解蛋白，所以自噬活性降低利于腫瘤生長。腫瘤的分化程度、TNM分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征與患者病情進(jìn)展密切相關(guān)，是評價(jià)患者預(yù)后的重要指標(biāo)，分化越低、TNM 分期越晚、浸潤深度越深及有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，病情進(jìn)展快，預(yù)后差。本研究結(jié)果提示beclin-1和LC3B 蛋白在低分化、Ⅲ+Ⅳ期、腸壁浸潤深度T3～T4及有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織中陽性表達(dá)率明顯低于中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、腸壁浸潤深度T1～T2及無遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率，在肝癌、食管鱗癌和胃癌組織中beclin-1和LC3B蛋白陽性表達(dá)率與臨床病理資料的研究中也得到與本研究一致的結(jié)果[11-13]，證明細(xì)胞自噬參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，beclin-1和LC3B蛋白可用來監(jiān)測腫瘤的發(fā)展以及患者的預(yù)后，可作為早期評估患者病情的重要指標(biāo)。

Figure 8. The effect of miR-337 over-expression on the migration ability of HCT116 cells (×200). Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group.

圖8 過表達(dá)miR-337對HCT116細(xì)胞遷移能力的影響

Green等[14]研究發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)p53能夠通過負(fù)性調(diào)節(jié)自噬活性參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示p53蛋白的表達(dá)與beclin-1和LC3B蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，敲減p53基因的表達(dá)水平后，細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1和LC3B表達(dá)明顯升高，從而證實(shí)了p53基因能夠負(fù)調(diào)節(jié)自噬活性，與前人的研究結(jié)果一致。p53 可通過AMPK途徑抑制mTOR 的活性，后者是抑制自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子之一，從而增強(qiáng)自噬[15]，為CRC的發(fā)生發(fā)展提供有利條件。Lorin等[16]研究表明p53能夠激活JNK，活化的JNK通過磷酸化Bcl-2蛋白而解除Bcl-2和beclin-1所形成的復(fù)合物的結(jié)合或上調(diào)DRAM表達(dá)，使細(xì)胞自噬發(fā)生?？啄萚17]證明了JNK/Bcl-2磷酸化介導(dǎo)的保護(hù)性自噬是HCT116 p53-/-和HT29細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的可能分子機(jī)制。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-337能夠下調(diào)HCT116細(xì)胞p53基因的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌的自噬進(jìn)程，并能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移，從而延緩或阻止結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。

總之，本研究證實(shí)細(xì)胞自噬參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并發(fā)現(xiàn)miR-337可能通過靶向調(diào)節(jié)抑制p53表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬。這為結(jié)腸癌的防治提供新的靶點(diǎn)。