血小板微粒通過(guò)激活單核細(xì)胞HIF-1α促進(jìn)血管生成的作用*

貝俊杰， 雷靈亮， 趙 芬， 孫 誠(chéng)， 農(nóng)耀明， 洪紹彩， 趙麗霞

(1武警廣西總隊(duì)醫(yī)院心內(nèi)科， 廣西 南寧 530003； 2廣州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科， 廣東 廣州 510180)

血小板不僅具有止血功能，在免疫反應(yīng)、炎癥和血管生成等方面也發(fā)揮重要的病理生理作用[1]。血小板被激活或發(fā)生凋亡時(shí)會(huì)釋放血小板微粒(platelet microparticles，PMP)，PMP表達(dá)和攜帶多種生物活性分子，可直接激活或傳遞信號(hào)至靶細(xì)胞，導(dǎo)致其表型和功能發(fā)生變化[2]。在冠心病和缺血性卒中等動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)疾病中，循環(huán)中PMP及血小板-單核細(xì)胞聚集體的數(shù)量明顯增多，并且與心血管不良事件的發(fā)生呈正相關(guān)[3-4]。急性心血管事件通常由斑塊破裂所引發(fā)，炎癥細(xì)胞特別是單核巨噬細(xì)胞在其中扮演了重要的角色，其通過(guò)吞噬脂質(zhì)、釋放炎癥介質(zhì)和促血管生成因子，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥聚集和新生血管形成，最終造成斑塊不穩(wěn)定[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PMP可以結(jié)合并激活單核細(xì)胞，促進(jìn)其產(chǎn)生致炎癥效應(yīng)[6]，但PMP激活單核細(xì)胞是否促進(jìn)血管生成尚不完全清楚。本研究旨在探討PMP通過(guò)單核細(xì)胞發(fā)揮促血管生成的作用及機(jī)制，為防治AS血管生成提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和動(dòng)物

人急性單核細(xì)胞性白血病THP-1細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。C57BL/6雄鼠(6～8周齡)購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)為SYXK(渝)2017-0002。

2 主要試劑

抗CD41a-PE單克隆抗體和Annexin V-APC染料購(gòu)自BD；流式熒光校準(zhǔn)微珠購(gòu)自BangsLabs；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天；ADP購(gòu)自Sigma；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTMII均購(gòu)自TaKaRa；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德；抗P-選擇素(P-selectin)中和性抗體和同型對(duì)照抗體購(gòu)自R&D；NE-PER?胞核及胞質(zhì)蛋白提取試劑購(gòu)自Thermo；TransAM低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Active Motif；Matrigel基質(zhì)膠和Transwell遷移小室均購(gòu)自Corning；VEGF購(gòu)自PeproTech；黑毛霉素(chetomin)購(gòu)自Alexis Biochemicals。

3 主要方法

3.1緩沖液配制 CGS緩沖液(120 mmol/L NaCl, 13 mmol/L Na3C6H5O7·2H2O, 30 mmol/L dextrose, pH 7.0)；Tyrode’s緩沖液(137 mmol/L NaCl, 2.8 mmol/L KCl, 12 mmol/L NaHCO3, 1 mmol/L MgCl2, 0.4 mmol/L Na2HPO4, 0.1% BSA, 10 mmol/L HEPES, 5.5 mmol/L glucose, pH 7.4)；ACD抗凝劑(21 mmol/L C6H8O7·H2O, 85 mmol/L Na3C6H5O7·2H2O, 83 mmol/L C6H12O6)。經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾備用。

3.2血液采集和血小板分離 人外周血取自我院18～30歲的正常獻(xiàn)血者，參與研究的獻(xiàn)血者均已簽訂科研知情同意書(shū)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。血液標(biāo)本用19G針頭采集，ACD抗凝，1 h內(nèi)用于血小板的分離。將ACD抗凝血置于離心管中，110×g離心15 min去除紅細(xì)胞及白細(xì)胞，獲得富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)；吸取PRP轉(zhuǎn)移至新的離心管中，710×g離心15 min，獲得血小板沉淀，棄去乏血小板血漿；加入CGS緩沖液洗滌血小板，共3次；洗滌后的血小板沉淀重懸于Tyrode’s緩沖液(含1 mmol/L CaCl2)中，調(diào)整血小板濃度至3×1011/L。

3.3PMP的制備和定量 將調(diào)整濃度的血小板懸液置入37 ℃恒溫箱中，與ADP(20 μmol/L)孵育15 min，激活血小板產(chǎn)生PMP；將激活后的血小板懸液經(jīng)710 ×g離心15 min，沉淀未被激活的血小板；吸取富含PMP的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，經(jīng)0.8 μm濾膜過(guò)濾進(jìn)一步去除殘留的血小板；25 000×g離心60 min沉淀PMP，吸取上清作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照，用Tyrode’s緩沖液重懸PMP，直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或速凍于-80 ℃并避免反復(fù)凍融。

向Tyrode’s緩沖液加入熒光校準(zhǔn)微珠(含直徑0.2、0.5和0.8 μm)，調(diào)節(jié)FACSVerseTM流式細(xì)胞儀，使之能同時(shí)分辨上述3種大小的微珠(表明適合進(jìn)行PMP檢測(cè))，固定并保存相關(guān)參數(shù)用于檢測(cè)。將待測(cè)PMP分成3管，并加入相應(yīng)的抗體或染料：a管,CD41a-PE+Annexin V-APC;b管,Iso-PE+Annexin V-APC;c管,CD41a-PE+Annexin V-APC(不含結(jié)合緩沖液)。4 ℃避光孵育30 min；向a管加入直徑為1和6 μm的熒光校準(zhǔn)微珠。流式細(xì)胞術(shù)分析：PE及APC雙陽(yáng)性且≤1 μm的事件(events)被定義為PMP，選用6 μm的微珠作為計(jì)數(shù)參照，按公式PMP(events/μL)=PMP events×beads concentration/beads events計(jì)算待測(cè)PMP的濃度。

3.4基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)膠預(yù)冷融化，按照實(shí)驗(yàn)分組，分別將Tyrode’s緩沖液、PMP(5×105)、PMP+chetomin(50 nmol/L)及VEGF(50 μg/L)與400 μL基質(zhì)膠混勻備用。將準(zhǔn)備好的基質(zhì)膠分別注射到C57BL/6雄鼠(6～8周齡)的右腹部皮下組織，2周后頸椎脫臼法處死小鼠；取出基質(zhì)膠用0.9%的生理鹽水漂洗3次，置于體視顯微鏡下觀察拍照；基質(zhì)膠多聚甲醛固定、石蠟包埋，5 μm切片后行HE染色，顯微鏡下觀察并采集圖片。

3.5細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞(培養(yǎng)基組成：88% RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺溶液，1%青霉素/鏈霉素溶液和10 mg/L多粘菌素B)和HUVECs(培養(yǎng)基組成：89% DMEM高糖培養(yǎng)基，10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液)復(fù)蘇后培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3～8代后用于實(shí)驗(yàn)。

3.6PMP與THP-1細(xì)胞結(jié)合 收集培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞，離心后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整濃度為2×108/L。取500 μL細(xì)胞懸液分別加入500 μL PMP上清液(對(duì)照)、3×105PMP(PMP∶cell=3∶1)和1×106PMP(PMP∶cell=10∶1)，根據(jù)需要同時(shí)加入P-selectin中和性抗體(1 mg/L)，在常氧(20% O2、5% CO2)或低氧(1% O2、5% CO2和94% N2)條件下，37 ℃培養(yǎng)12 h或24 h。

3.7RT-qPCR法檢測(cè)目的基因的mRNA表達(dá) 收集處理后的細(xì)胞懸液，離心后吸取細(xì)胞上清液備用。細(xì)胞沉淀用RNAiso Plus裂解，經(jīng)氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌、室溫干燥后，用無(wú)核酸酶的水溶解RNA沉淀，NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及純度，選取合格標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒及PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按說(shuō)明書(shū)步驟操作。qPCR所用引物由Invitrogen公司合成(序列見(jiàn)表1)，采用SYBR? Premix Ex TaqTMII配制反應(yīng)體系，利用CFX96TMReal-Time System進(jìn)行PCR，用軟件計(jì)算基因的Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列

3.8ELISA實(shí)驗(yàn) 取收集好的細(xì)胞上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)VEGF的分泌水平。

3.9核蛋白的提取及定量 收集處理后的THP-1細(xì)胞沉淀，按蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)在冰上進(jìn)行操作，獲得細(xì)胞核蛋白，以BCA法定量，直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或速凍于-80 ℃并避免反復(fù)凍融。

3.10HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn) 取THP-1細(xì)胞核蛋白提取物，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性。

3.11基質(zhì)膠管腔形成實(shí)驗(yàn) 將預(yù)冷融化的基質(zhì)膠包被于24孔板中，避免產(chǎn)生氣泡，包被后的孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中聚合30～60 min。將饑餓24 h的HUVECs按每孔1×104接種于基質(zhì)膠上，待HUVECs貼壁后將Transwell遷移小室置于孔板之上，構(gòu)建體外單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。按照實(shí)驗(yàn)分組，分別向上室加入培養(yǎng)基、THP-1細(xì)胞(每孔5×104)、PMP(每孔5×105)、THP-1細(xì)胞+PMP、chetomin(50 nmol/L)、THP-1細(xì)胞+PMP+chetomin和VEGF(50 μg/L)。共培養(yǎng)12 h后，移去Transwell小室，顯微鏡下選擇上下左右中5個(gè)視野觀察各孔的管腔形成情況并拍照。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，多組間比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PMP誘導(dǎo)體內(nèi)血管生成

基質(zhì)膠栓大體觀察發(fā)現(xiàn)，含有PMP和VEGF(陽(yáng)性對(duì)照)的基質(zhì)膠表面新生血管明顯，分枝豐富；而含PMP上清液(陰性對(duì)照)的基質(zhì)膠幾乎透明，沒(méi)有新生血管存在，與前2組相比顯著減少(P<0.01),見(jiàn)圖1A?；|(zhì)膠栓切片后鏡下觀察，PMP和VEGF組可見(jiàn)體積較大或數(shù)量較多的管腔結(jié)構(gòu)，且有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，而PMP上清液組未見(jiàn)管腔結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1B。HIF-1α參與調(diào)控多種血管生成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，采用chetomin(干擾HIF-1與其轉(zhuǎn)錄輔激活因子p300的相互作用)選擇性抑制HIF-1α的活性導(dǎo)致PMP組的新生血管明顯減少，見(jiàn)圖1。

2 PMP促進(jìn)THP-1細(xì)胞釋放VEGF

PMP可以直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管，也可能通過(guò)刺激炎癥細(xì)胞釋放促血管生成物質(zhì)間接促進(jìn)血管生成[7]。單核細(xì)胞是主要的炎癥細(xì)胞之一，在炎癥反應(yīng)與血管生成中發(fā)揮重要作用。常氧條件下，PMP可促進(jìn)THP-1細(xì)胞釋放VEGF，效應(yīng)呈PMP劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性(P<0.01)，見(jiàn)圖2A。HIF-1α存在于單核細(xì)胞中，可被缺氧激活，動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化時(shí)內(nèi)膜下的單核細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)，因此我們模擬缺氧環(huán)境進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，PMP在缺氧條件下能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放VEGF，與常氧條件下產(chǎn)生的效應(yīng)趨勢(shì)一致(P<0.05),見(jiàn)圖2B。

Figure 1. PMP induced angiogenesisinvivomediated by HIF-1α. A: the photographs of each Matrigel plug under a stereo microscope (×8) and the numbers of new vessel branches that formed in the Matrigel plugs; B: paraffin-embedded implantation plug sections were stained with hematoxylin and eosin, and new vessel formation (black arrows) was observed (×200). Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsPMP group.

圖1 PMP誘導(dǎo)體內(nèi)血管生成

Figure 2. PMP provoked the release of VEGF in the THP-1 cells in a time- and dose-dependent manner under normoxia (A) and hypoxia (B) conditions. The THP-1 cells were treated with PMP supernatant (control) and PMP (ratio of PMP to cell was 3∶1 or 10∶1) for indicated time. The VEGF levels in the supernatants of THP-1 cells were detected by ELISA. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsPMP (3∶1) group;△△P<0.01vs12 h group.

圖2 PMP促進(jìn)THP-1細(xì)胞釋放VEGF

3 PMP上調(diào)THP-1細(xì)胞VEGF和HIF-1α的mRNA表達(dá)

在基因表達(dá)方面，常氧條件下PMP與THP-1細(xì)胞作用12 h，可上調(diào)THP-1細(xì)胞VEGF及其上游轉(zhuǎn)錄基因HIF-1α的mRNA的表達(dá)，效應(yīng)呈PMP劑量依賴(lài)性(P<0.01),見(jiàn)圖3A。在缺氧條件下，PMP也能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞VEGF和HIF-1α的mRNA表達(dá)(P<0.05),見(jiàn)圖3B。

4 PMP激活THP-1細(xì)胞HIF-1α促進(jìn)VEGF的生成

常氧條件下，PMP與THP-1細(xì)胞共孵育12 h，THP-1細(xì)胞HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)，采用P-選擇素中和性抗體(Psel Ab)阻礙PMP與THP-1細(xì)胞的結(jié)合，該活性明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖4A。相應(yīng)的，Psel Ab可明顯抑制PMP激活THP-1細(xì)胞釋放和表達(dá)VEGF(P<0.05),見(jiàn)圖4B、C。另一方面，使用chetomin抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，THP-1細(xì)胞VEGF的釋放和mRNA表達(dá)也明顯減少(P<0.05),見(jiàn)圖4D、E。這些結(jié)果提示，PMP與THP-1細(xì)胞的結(jié)合可導(dǎo)致HIF-1α激活，進(jìn)而啟動(dòng)下游基因VEGF，促進(jìn)其蛋白表達(dá)。

Figure 3. PMP up-regulated mRNA expression of VEGF and HIF-1α in the THP-1 cells in a dose-dependent manner. The THP-1 cells were treated with PMP supernatant (control) and PMP (ratio of PMP to cell was 3∶1 or 10∶1) for 12 h. A: normoxia; B: hypoxia. Mean±SEM.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsPMP (3∶1) group.

圖3 PMP上調(diào)THP-1細(xì)胞VEGF和HIF-1α的mRNA表達(dá)

Figure 4. HIF-1α regulated PMP-induced VEGF production in the THP-1 cells. A～C: THP-1 cells were treated with PMP in the presence of P-selectin neutralizing antibody under normoxia condition for 12 h. Transcriptional activity of HIF-1α was tested by TransAM HIF-1α Kit. VEGF at protein and mRNA levels were also tested. Iso Ab: isotype antibody; Psel Ab: P-selectin antibody. D and E: PMP-induced release and mRNA expression of VEGF in the THP-1 cells were suppressed by che-tomin under normoxia condition. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsPMP group or PMP+Iso Ab group.

圖4 PMP通過(guò)激活THP-1細(xì)胞HIF-1α促進(jìn)VEGF的生成

5 PMP通過(guò)激活THP-1細(xì)胞HIF-1α促進(jìn)HUVECs在體外形成管腔樣結(jié)構(gòu)

為觀察PMP激活THP-1細(xì)胞HIF-1α是否具有促血管作用，我們構(gòu)建單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，常氧條件下PMP作用于THP-1細(xì)胞12 h，可促進(jìn)HUVECs在體外基質(zhì)膠上形成管腔樣結(jié)構(gòu)，該效應(yīng)可被chetomin明顯抑制(P<0.01)，見(jiàn)圖5。值得注意的是，PMP本身也可促進(jìn)HUVECs形成管腔樣結(jié)構(gòu)的作用，這一結(jié)果與既往研究相符，為PMP促血管生成的直接作用。

討 論

PMP為直徑0.1～1 μm的超微膜囊泡，其不單純是血栓及炎癥性疾病的生物學(xué)標(biāo)記物，更是具備功能的生物小體，且較血小板具有更大的活性表面積[7]。此外，與血小板激活后在局部聚集不同，PMP還可隨血液循環(huán)流動(dòng)，作用范圍更加廣泛。單核細(xì)胞作為主要的免疫細(xì)胞，被激活或受調(diào)控后可分化成不同功能的細(xì)胞和亞型，展現(xiàn)出吞噬、致炎癥及促血管生成等作用[5]。研究顯示PMP與單核細(xì)胞結(jié)合后，不僅能增強(qiáng)單核細(xì)胞在血管損傷部位的黏附[8]，還能誘導(dǎo)其釋放炎癥因子產(chǎn)生致炎癥效應(yīng)[6,9]，提示PMP可通過(guò)單核細(xì)胞在AS中發(fā)揮作用。

Figure 5. The interaction between PMP and THP-1 cells resulted in capillary-like network formation of HUVECsinvitromediated by HIF-1α. The THP-1 cells were treated with PMP in the presence of HIF-1α inhibitor chetomin under normoxia condition for 12 h, and the number of tube formation was observed under an inverted light microscope (×10). A: the photographs of representative field from each group; B: the diagram of a Transwell co-culture setup; C: the quantitative analysis of the tube number. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsblank group;##P<0.01vsPMP+THP-1 group.

圖5 PMP通過(guò)激活THP-1細(xì)胞HIF-1α促進(jìn)HUVECs在體外形成管腔

血管生成是AS主要的病理過(guò)程之一，而斑塊內(nèi)的血管生成則是導(dǎo)致AS進(jìn)展和斑塊不穩(wěn)定的重要因素[10]。本研究首先用基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)?zāi)M在體情況，發(fā)現(xiàn)PMP可誘導(dǎo)新生血管形成，該效應(yīng)在抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性后明顯減弱，提示HIF-1α參與介導(dǎo)PMP的促血管生成作用。既往研究顯示，HIF-1α、VEGF和巨噬細(xì)胞共同存在于病人AS斑塊內(nèi)的缺氧區(qū)域，缺氧、氧化低密度脂蛋白、炎癥因子等理化生物因素可刺激單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促血管生成效應(yīng)[11-12]。我們的結(jié)果顯示，無(wú)論在常氧還是缺氧條件下，PMP均可促進(jìn)單核細(xì)胞釋放VEGF，并上調(diào)VEGF及其調(diào)控基因HIF-1α的mRNA表達(dá)。此外，PMP還能增強(qiáng)單核細(xì)胞HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，抑制該活性導(dǎo)致VEGF生成減少。與激活的血小板相似，PMP主要依靠P-selectin介導(dǎo)其與靶細(xì)胞之間的相互作用。因此，我們利用中和性抗體阻礙P-selectin與單核細(xì)胞表面P-選擇素糖蛋白配體1的結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性被大部分抑制，同時(shí)單核細(xì)胞VEGF的釋放和mRNA表達(dá)也明顯減少，這些結(jié)果說(shuō)明，PMP可能通過(guò)與單核細(xì)胞結(jié)合并激活其HIF-1α促進(jìn)VEGF的生成。然而，PMP是否還通過(guò)膜融合或內(nèi)吞等其他方式作用于單核細(xì)胞進(jìn)而激活HIF-1α尚不清楚。

為判斷HIF-1α激活后單核細(xì)胞是否產(chǎn)生促血管生成效應(yīng)，我們觀察其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞體外形成管腔的影響。結(jié)果顯示在PMP激活的單核細(xì)胞組，內(nèi)皮細(xì)胞成管數(shù)量明顯增加，抑制HIF-1α可大部分減弱上述效應(yīng)，進(jìn)一步說(shuō)明PMP激活單核細(xì)胞產(chǎn)生促血管生成效應(yīng)由HIF-1α所介導(dǎo)。HIF-1α的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，研究表明單核細(xì)胞來(lái)源的HIF-1α可以被PI3K-Akt通路磷酸化激活[13-14]，而PMP依靠P-selectin與單核細(xì)胞結(jié)合又可以活化PI3K-Akt通路[9]，由此推測(cè)PMP可能通過(guò)P-selectin-PI3K-Akt-HIF-1α信號(hào)通路激活單核細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。此外，我們還發(fā)現(xiàn)PMP可直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔，這可能與PMP向內(nèi)皮細(xì)胞傳遞脂質(zhì)類(lèi)生長(zhǎng)因子或上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)有關(guān)[15-16]，表明PMP促血管生成的方式具有多樣性。然而，AS血管生成的過(guò)程和調(diào)控非常復(fù)雜，目前的結(jié)果需要在AS動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究初步表明PMP在體外可以通過(guò)單核細(xì)胞產(chǎn)生促血管生成效應(yīng)，機(jī)制涉及PMP與單核細(xì)胞結(jié)合并激活其HIF-1α。該結(jié)果可為AS血管新生提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。