c-SKI對冠脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響*

王 娟， 幸世峰， 呂忠英， 李 鵬， 李紅建， 羅 梅

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 新疆 烏魯木齊 830011)

內(nèi)皮細(xì)胞在特定的病理狀態(tài)下可以向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其表型及功能也隨之改變,即內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，End-MT)。研究表明End-MT異?；罨瘜?dǎo)致胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成增加進(jìn)而促進(jìn)心肌纖維化發(fā)生，而抑制End-MT則能抑制心肌纖維化進(jìn)展[1-3]。End-MT涉及很多因素，其調(diào)控機(jī)制尚有待于研究。c-SKI(cellular Sloan-Kettering Institute)是從Sloan-Kettering逆轉(zhuǎn)錄病毒中分離出來的，c-ski原癌基因編碼的核蛋白，幾乎在所有的哺乳動物組織中存在和表達(dá)，對轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smad信號通路存在負(fù)性調(diào)控作用，具有生物多效性，既往研究表明其在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)、創(chuàng)傷修復(fù)及糖脂代謝等過程均有重要的作用[4]。亦有研究表明c-SKI可以調(diào)控成纖維細(xì)胞的表型，從而具有抗纖維化的特性[5]，然而c-SKI在End-MT中的作用罕有報道。本研究應(yīng)用過表達(dá)c-SKI進(jìn)行干預(yù)，擬探討c-SKI在人冠狀動內(nèi)皮細(xì)胞(human coronary artery endothelial cells，HCAECs)增殖及End-MT中的作用

材 料 和 方 法

1 主要材料

TGF-β1購自R&D System；攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的c-ski慢病毒載體(克隆號HO003036)構(gòu)建包裝購自湖南贏潤生物技術(shù)有限公司；10%胎牛血清、0.25%胰酶和左旋谷氨酰胺均購自HyClone；青鏈霉素雙抗溶液購自Gibco；DMEM/F12培養(yǎng)基購自Invitrogen；MTT和DMSO均購自Sigma；RIPA 裂解液、BCA蛋白定量分析試劑盒和Pierce ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色劑均購自Thermo Fisher；抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin, E-cad)、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和GAPDH抗體均購自Cell Signaling Technology；抗c-SKI、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(vi-mentin)抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗購自Santa Cruz；TRIzol RNA提取試劑購自TaKaRa；RT-qPCR引物序列合成由上海生工生物有限公司完成。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及感染 HCAECs購自Lonza。用10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含有1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)。培養(yǎng)至匯合狀態(tài)，再用0.25%胰酶和0.02% EDTA混合液消化、傳代，至2～5代用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞融合70%左右，換用無血清培養(yǎng)基饑餓6 h，隨后進(jìn)行細(xì)胞感染。在6孔板中按每孔1×106個細(xì)胞接種，病毒滴度為1×108TU/L進(jìn)行感染，觀察細(xì)胞狀態(tài)，感染48 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率鑒定并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT實(shí)驗(yàn) 將HCAECs以每孔2×104個接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，使用TGF-β1刺激或不刺激后分別用過表達(dá)c-SKI慢病毒(LV-SKI)和對照病毒(LV-NC)感染細(xì)胞。加入MTT至終濃度為0.5 g/L，將細(xì)胞在37 ℃下溫育4 h。通過微量板讀數(shù)器(Bio-Rad)測量490 nm處的吸光度(A)值。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3集落形成實(shí)驗(yàn) 在給予或不給TGF-β1刺激的情況下，分別用過表達(dá)c-SKI慢病毒和對照病毒感染HCAECs。將細(xì)胞懸浮在含有0.35%瓊脂糖的低熔點(diǎn)RPMI-1640中，以每皿1×105個細(xì)胞接種在0.6%瓊脂糖的6孔板中。將平板在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色后統(tǒng)計集落數(shù)量。

2.4RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 用TRIzol試劑盒按說明書提取HCAECs總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。加入SYBR Premix Ex Taq，進(jìn)行實(shí)時定量PCR。采用熒光定量 PCR儀擴(kuò)增檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平，GAPDH作為內(nèi)參照。采用 2-ΔΔCt方法分析結(jié)果，每組3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。c-SKI的上游引物序列為5’-AGCACCGAGTTGAGAATCTGC-3’，下游引物序列為5’-ACTGGAAGGCGAGACCATCT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’，下游引物序列為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 在不同處理后，收獲HCAECs并用裂解緩沖液勻漿，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。通過8%～10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)(30 μg)，轉(zhuǎn)PVDF膜。使用抗c-SKI、α-SMA、E-cad、vimentin 和GAPDH特異性 I 抗(1∶1 000)，抗Smad2和Smad3特異性 I 抗(1∶2 000)及抗p-Smad2和p-Smad3特異性 I 抗(1∶1 000)孵育，用5%脫脂奶粉封閉。后將膜進(jìn)一步與相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(1∶5 000)一起溫育2 h，TBST洗膜3次，以ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色后成像，ImageJ軟件分析測試結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行作圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 c-SKI在TGF-β1誘導(dǎo)的HCAECs中的表達(dá)

通過Western blot檢測TGF-β1刺激后HCAECs中c-SKI的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，分別給予不同濃度TGF-β1(0、1、2.5和5 μg/L)作用48 h后，c-SKI的表達(dá)呈劑量依賴性下降，與空白對照組比，5 μg/L濃度組的HCAECs中c-SKI表達(dá)下降最顯著(P<0.01)，見圖1A。后選擇5 μg/L濃度的TGF-β1繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，分別作用于HCAECs 0 h、12 h、24 h和48 h，Western blot檢測顯示，c-SKI的表達(dá)呈時間依賴性下降，處理48 h后c-SKI表達(dá)下降最顯著(P<0.01)，見圖1B。

Figure 1. The expression of c-SKI in the HCAECs treated with TGF-β1. A: Western blot analysis of c-SKI expression in the HCAECs treated with TGF-β1 at different concentrations; B:Western blot analysis of c-SKI expression in the HCAECs treated with TGF-β1 at 5 μg/L for different times. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μg/L group;#P<0.05;##P<0.01vs0 h group.

圖1 c-SKI在TGF-β1誘導(dǎo)下的冠脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)

2 不同濃度TGF-β1對HCAECs內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

不同濃度的TGF-β1作用于HCAECs 48 h后，Western blot檢測End-MT關(guān)鍵標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，TGF-β1組細(xì)胞中E-cad蛋白表達(dá)呈劑量依賴性下調(diào)，而vimentin和α-SMA表達(dá)呈劑量依賴性上升，5 μg/L濃度時效果最為顯著(P<0.01)，見圖2。

3 HCAECs過表達(dá)c-SKI的效率檢測

將c-SKI過表達(dá)慢病毒感染冠脈內(nèi)皮細(xì)胞，48 h后用倒置熒光顯微鏡可見，病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染率在80%以上，見圖3A。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與對照病毒組相比，轉(zhuǎn)染后的HCAECs中c-SKI的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖3B。

4 過表達(dá)c-SKI對HCAECs增殖的影響

使用MTT和集落形成實(shí)驗(yàn)分別檢測HCAECs的增殖情況。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LV-NC+TGF-β1組相比，過表達(dá)c-SKI可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HCAECs活力(P<0.01)，見圖4A。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LV-NC+TGF-β1組相比，過表達(dá)c-SKI可以減少HCAECs的集落形成數(shù)量(P<0.01)，見圖4B。

Figure 2. Western blot analysis of vimentin, α-SMA and E-cadherin (E-cad) in the HCAECs treated with TGF-β1 at different concentrations. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μg/L group.

圖2 Western blot檢測TGF-β1對HCAECs中vimentin、α-SMA及E-cadherin表達(dá)的影響

Figure 3. Detection of LV-SKI transfection efliciency. A: the images of green fluorescent protein expression for observing the efficiency of LV-SKI transfection (48 h after transfection, ×200); B: the mRNA expression of c-SKI after infection was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsLV-NC group.

圖3 慢病毒c-SKI過表達(dá)載體感染效率鑒定

5 過表達(dá)c-SKI對HCAECs內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化分子標(biāo)志物的影響

采用Western blot檢測各組細(xì)胞End-MT相關(guān)分子標(biāo)志物vimentin、α-SMA及E-cad蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與空白對照組比，TGF-β1組和LV-NC+TGF-β1組的HCAECs中vimentin和α-SMA的蛋白表達(dá)均顯著增加，E-cad蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，TGF-β1組和LV-NC+TGF-β1組HCAECs中α-SMA和E-cad蛋白表達(dá)無明顯變化。與LV-NC+TGF-β1組相比，LV-SKI+TGF-β1組HCAECs中可見vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而E-cad蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)，見圖5。

Figure 4. The effect of c-SKI on HCAECs proliferation. A: the changes of the cell viability; B: the images and quantitative analysis of the colony formation assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLV-NC+TGF-β1 group.

圖4 過表達(dá)c-SKI對冠脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

Figure 5. Expression of vimentin, α-SMA and E-cadherin (E-cad) in the HCAECs treated with TGF-β1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsLV-NC+TGF-β1 group.

圖5 Western blot檢測vimentin、α-SMA及E-cadherin的表達(dá)

6 過表達(dá)c-SKI對TGF-β/Smad信號通路的影響

采用Western blot檢測TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵信號分子Smad2和Smad3蛋白的磷酸化情況。過表達(dá)c-SKI后，各組細(xì)胞Smad2和Smad3的蛋白水平無明顯變化；與LV-NC+TGF-β1組對比，LV-SKI+TGF-β1組的p-Smad2和p-Smad3蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖6。

討 論

End-MT是一種受到高度調(diào)節(jié)的病理過程，涉及內(nèi)皮功能障礙、炎癥以及多個信號通路，已被確定為調(diào)節(jié)纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵機(jī)制[6-7]。在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化小鼠模型中，抑制End-MT可以抑制心肌纖維化改善心肌重構(gòu)[8]，在TGF-β1誘導(dǎo)的End-MT研究中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[1]。Kato等[9]檢測了心房顫動患者纖維化的心房組織，發(fā)現(xiàn)了End-MT的轉(zhuǎn)錄因子以及能產(chǎn)生膠原的間質(zhì)細(xì)胞表型，在人體方面證實(shí)了End-MT參與了心肌纖維化。重要的是，在疾病進(jìn)程中End-MT的過程是動態(tài)的，間質(zhì)細(xì)胞可以向內(nèi)皮方向逆向轉(zhuǎn)化[10]。因此，逆轉(zhuǎn)End-MT可以為心肌纖維化及其他心血管疾病提供新的思路，值得進(jìn)一步深入研究。

Figure 6. Expression of p-Smad2, p-Smad3 in the HCAECs treated with TGF-β1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLV-NC+TGF-β1 group.

圖6 Western blot檢測p-Smad2和p-Smad3蛋白水平的變化

c-SKI是SKI蛋白家族的一員，在正常心肌組織中含量較低，但作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。c-SKI能夠作為靶基因參與調(diào)節(jié)心肌成纖維細(xì)胞和ECM的合成[11]，在心肌細(xì)胞H9C2中沉默c-SKI的表達(dá)可以促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[12]。由此可見，c-SKI在心肌纖維化和EMT中均有重要的作用，但目前關(guān)于其對HCAECs以及End-MT的影響研究甚少。

最新研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞是成年大鼠心臟細(xì)胞中非心肌細(xì)胞數(shù)量最多的類型，其發(fā)生End-MT是心肌纖維化的關(guān)鍵因素[13]，而TGF-β1作為促進(jìn)纖維化的重要因子，在End-MT中也有同樣重要的作用[14]。因此，本研究使用TGF-β1誘導(dǎo)HCAECs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用不同濃度的TGF-β1處理HCAECs，觀察內(nèi)源性c-SKI表達(dá)變化，并驗(yàn)證TGF-β1對HCAECs中End-MT的誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以抑制c-SKI的表達(dá)，呈劑量及時間依賴性，同時HCAECs表現(xiàn)出End-MT表型，由此可見，上調(diào)TGF-β1表達(dá)及下調(diào)c-SKI表達(dá)協(xié)同促進(jìn)了內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。據(jù)報道，低濃度(0.25～2 μg/L)的TGF-β1便足以誘導(dǎo)End-MT的發(fā)生，而5 μg/L效果比10 μg/L更為顯著[15]，本研究結(jié)果與報道一致。此外，MTT和集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明c-SKI能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HCAECs增殖，與c-SKI抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖的研究結(jié)果類似[12]。但c-SKI調(diào)控細(xì)胞增殖的作用具有雙重性，在皮膚瘢痕愈合中，c-SKI能夠促進(jìn)真皮中成纖維細(xì)胞增殖[16]，提示c-SKI在不同病理?xiàng)l件下作用存在差異性。c-SKI與TGF-β/Smad信號通路的關(guān)系既往已有研究。在生理狀態(tài)下c-SKI能夠適當(dāng)限制Smads介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，避免機(jī)體產(chǎn)生過多的TGF效應(yīng)。在心肌纖維化病理進(jìn)程中，c-SKI負(fù)性調(diào)控TGF-β/Smad信號通路是抑制胞外基質(zhì)產(chǎn)生的重要機(jī)制[5]，而在內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控中，Smad2和Smad3又是介導(dǎo)TGF-β通路的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，c-SKI過表達(dá)可以抑制HCAECs中p-Smad2和p-Smad3蛋白的表達(dá)，提示c-SKI抑制HCAECs增殖及End-MT的機(jī)制可能與抑制TGF-β/Smad信號通路的活性有關(guān)。而Li等[18]的最新研究有不一樣的發(fā)現(xiàn)，提出c-SKI并不是通過經(jīng)典的TGF-β/Smad信號通路，而是通過ERK/CREB信號通路在TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。c-SKI的調(diào)節(jié)作用廣泛涉及多個信號通路，需要更多的研究去探討。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)，在HCAECs中TGF-β1能劑量時間依賴性抑制c-SKI的表達(dá)，誘導(dǎo)HCAECs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，使其失去原有內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原，表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化特有抗原。而過表達(dá)c-SKI可以抑制冠脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并且抑制HCAECs中vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)而增強(qiáng)E-cad蛋白的表達(dá)，從而部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的End-MT。本研究還存在一定的不足和局限性，不同的誘導(dǎo)時間或條件下TGF-β1對細(xì)胞可能存在雙向調(diào)節(jié)效應(yīng)，而本實(shí)驗(yàn)觀察的時間窗有限，延長誘導(dǎo)時間后是否仍有一致的作用有待進(jìn)一步觀察，并且該研究需要在動物實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)驗(yàn)證。