益氣養(yǎng)陰方通過激活ERK/Nrf2/HO-1通路減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷*

柴松波， 司富春， 王振濤， 張淑娟， 劉舜禹

(1河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心病科， 河南 鄭州 450002； 2河南中醫(yī)藥大學(xué)， 河南 鄭州 450046)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)屬于臨床常見代謝疾病。調(diào)查顯示，近年來DM發(fā)病率逐漸升高，患者機(jī)體糖脂長期代謝紊亂會引發(fā)器官病理性損傷，其中心臟是受累較常見的器官之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)DM患者中因心衰或心肌梗死死亡的患者為非DM患者數(shù)量的3倍，因此探究DM并發(fā)心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)的發(fā)生機(jī)制對于冠心病的治療、預(yù)后有十分積極的意義[2]。益氣養(yǎng)陰方由人參、黃芪、山藥和丹參等中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰和降脂降糖的功效，能夠降低DM患者的血糖和血脂[3]，然而其對DM合并MIRI是否也具有功效，目前尚不明確。本研究通過制備DM+MIRI大鼠，給予益氣養(yǎng)陰方治療，以期觀察其對DM+MIRI大鼠的心肌保護(hù)作用，為DM合并MIRI的臨床治療提供一定的參考。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

雄性SD大鼠，SPF級，8周齡，體重200～220 g，由河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SYXK(豫)2017-0005。所有大鼠均置于22～25 ℃，濕度50%～60%，光暗循環(huán)12 h(12 h黑暗、12 h光照)的環(huán)境內(nèi)統(tǒng)一飼養(yǎng)，期間大鼠自由飲水、攝食，適應(yīng)1周后，用于模型制備。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)同意，且實驗處理符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，倫理審批號為IACUC-20170208038。

2 主要試劑與儀器

益氣養(yǎng)陰方(黃芪、山藥、熟地、山萸肉、丹參各15 g，黃精、枸杞各12 g，人參、當(dāng)歸、知母、澤瀉、川芎、地骨皮各10 g，在水中浸泡30 min，水煎2次，每次30 min，紗布過濾后去渣，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，生藥終濃度分別為750 g/L、1 500 g/L和3 000 g/L，高壓滅菌后儲存?zhèn)溆?；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和伊文思藍(lán)(Sigma)；心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素 10(interleukin-10，IL-10)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物工程公司)；核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)激活劑bardoxolone methyl(北京百奧萊博科技有限公司)；蘇木精-伊紅 (hematoxylin-eosin， HE) 染色試劑盒和氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染液(中杉金橋)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測定法 [terminal dexynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL] 染色試劑盒(北京市中山生物技術(shù)有限公司)；蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒(TaKaRa)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(上海研拓生物科技有限公司)；抗磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)、Nrf2、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)和β-肌動蛋白(β-actin)抗體(R&D)；山羊抗兔HRP標(biāo)記 II 抗(CST)。全自動生化檢測儀和垂直電泳儀(Beckman Coulter)；免疫熒光顯微鏡和光學(xué)顯微鏡(Olympus)。

3 方法

3.1糖尿病模型的制備 參照文獻(xiàn)[4]復(fù)制DM大鼠，所有大鼠飼養(yǎng)4周后，禁食12 h，選取95只大鼠腹腔注射55 mg/kg STZ，72 h后取大鼠尾靜脈血檢測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，以FBG水平≥16.7 mmol/L評定DM大鼠制備成功[5]。另外設(shè)定正常對照(control)組，僅注射等量枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液。

3.2DM+MIRI模型的制備 DM大鼠正常喂養(yǎng)3周后制備MIRI模型[6]，腹腔注射2% 2 mL/kg的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管切開連接小動物呼吸機(jī)，開胸暴露心臟，于左心耳根部下4 mm用6-0絲線結(jié)扎冠狀動脈左前降支，心電圖示R波升高同時伴ST段抬高，表明心肌缺血成功，結(jié)扎持續(xù)45 min后解開絲線，心電圖示ST段明顯回落表明心肌缺血再灌注，持續(xù)灌注3 h，之后還納心臟，逐層縫合胸部肋骨、肌肉和皮膚，其中5只大鼠因感染死亡，共成功制備DM+MIRI模型大鼠75只，另將15只DM大鼠僅以絲線穿過左前降支根部，不結(jié)扎，作為DM假手術(shù)(DM-sham, DM-S)組。

3.3動物給藥與分組 將3.2中DM+MIRI模型大鼠分為:DM+MIRI組，益氣養(yǎng)陰方低、中、高劑量(TL、TM和TH)組，Nrf2激活劑(bardoxolone methyl)組。每組均15只。另設(shè)DM-S組和control組各15只。益氣養(yǎng)陰方組：于DM+MIRI模型制備后灌胃大鼠7.5、15和30 g/kg益氣養(yǎng)陰方水煎液，灌藥量10 mL/100 kg，每天1次，連續(xù)給藥7 d。Nrf2激活劑組：每天灌胃大鼠30 mg/kg bardoxolone methyl，每天1次，連續(xù)給藥7 d。control組、DM-S組和DM+MIRI組大鼠僅灌胃等量生理鹽水，持續(xù)7 d。

3.4FBG、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)和高密度脂蛋白膽固醇(high- density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平的測定 末次給藥后采集尾靜脈血1 mL，葡萄糖氧化酶法檢測FBG含量；全自動血液分析儀檢測血清中TC、TG和HDL-C水平。

3.5超聲檢測大鼠心臟功能的變化 末次給藥后，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)充分麻醉大鼠，采用多普勒彩色超聲檢測儀，選取二維模式測定左心長軸切面，檢測心率(heart rate, HR)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)和左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)，連續(xù)3個完整心動周期，取平均值。

3.6血清cTnI、TNF-α、IL-1β和IL-10水平的檢測 采用ELISA試劑盒檢測血清中cTnI、TNF-α、IL-1β和IL-10水平，具體參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

3.7心臟的TTC染色 末次給藥后，每組隨機(jī)挑選6只大鼠，麻醉處死迅速解剖獲取心臟，于-20 ℃放置過夜。橫向切割左心室成5片，添加1%TTC染液，室溫孵育20 min后置于4%中性甲醛溶液中固定。藍(lán)色部分為正常心肌組織，紅色部分為缺血危險組織，白色部分為梗死組織。采用ImageJ軟件定量大鼠梗死體積，計算心肌梗死體積百分比(%)=白色區(qū)域體積/紅色區(qū)域體積×100%。

此次中國藝術(shù)家代表團(tuán)由中國《雕塑》雜志社社長范偉民先生率領(lǐng)23位成員出席，參加作品展出的藝術(shù)家有張英超（魯迅美術(shù)學(xué)院教授）、李倩（美國克利夫蘭大學(xué)教授）、武非（北京工業(yè)大學(xué)藝術(shù)設(shè)計學(xué)院副院長）、李永康（新疆藝術(shù)學(xué)院副教授）、李建國、朱林、羅澤仁、鄧華山、張文山、魚苗、羅彬文、胥文武、劉欽等著名立體造型藝術(shù)家和相關(guān)專業(yè)藝術(shù)同仁。

3.8標(biāo)本采集 末次給藥后，將各組剩余9只大鼠充分麻醉后，于大鼠頸總動脈逆行注射1 mL 0.5%伊文思藍(lán)，迅速解剖獲取心臟，獲取心臟組織清洗后，將非心肌組織去除，取心室橫徑最大部分心肌組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h后，制備心肌組織石蠟切片；部分心肌梗死區(qū)組織用于冷凍切片制備，剩余組織置于液氮中保存。

3.9HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)的變化 將心肌組織石蠟切片烘烤后、脫蠟、脫水后，參照HE染色試劑盒進(jìn)行染色，將切片置于顯微鏡下，觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化。

3.10TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡情況 心肌組織石蠟切片脫蠟脫水后添加不含DNase的蛋白酶K，用TUNEL檢測液37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，于熒光顯微鏡鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡數(shù)情況，ImageJ軟件定量細(xì)胞陽性數(shù)量，計算心肌細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞陽性數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

3.11Western blot檢測心肌組織p-ERK1/2、Nrf2和HO-1蛋白的水平 取出保存心肌組織，添加RIPA蛋白裂解液裂解30 min，抽提總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，SDS-PAGE分離等量蛋白，冰上行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，添加BSA封閉，清洗后添加抗p-ERK1/2、Nrf2、HO-1和β-actin的抗體(1∶500)，4 ℃過夜孵育，添加HRP標(biāo)記 II 抗(1∶5 000)，室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光顯影后置于凝膠成像儀中，以β-actin為內(nèi)參照，采用Image-Pro Plus軟件對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。

3.12心肌組織中SOD活性及MDA和ROS水平的檢測 稱取1 mg心肌組織，添加預(yù)冷PBS(9 mL)在勻漿機(jī)中制備組織勻漿液，離心后取上清進(jìn)行檢測，參考SOD檢測試劑盒采用氮藍(lán)四唑顯色法檢測SOD活性，硫代巴比妥酸比色法檢測勻漿液中MDA水平，鐵離子還原法檢測勻漿液的ROS水平，分別繪制SOD、MDA和FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品測定結(jié)果分別計算待測組織勻漿中的SOD活性(×103U/g)、MDA含量(μmol/g)和ROS水平(μmol/g)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)描述，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較采用SNK-q檢驗，當(dāng)P<0.05時則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠血清FBG、TC、TG和HDL-C水平的比較

與control組相比，DM-S組和DM+MIRI組的FBG、TC和TG水平均升高，HDL-C水平降低(P<0.05)；與DM-S組和DM+MIRI組相比，益氣養(yǎng)陰方各組和bardoxolone methyl組的FBG、TG和TC水平均降低，HDL-C水平升高 (P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Comparison of FBG, TC, TG and HDL-C levels in each group. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDM-S group;#P<0.05vsDM+MIRI group.

圖1 各組大鼠血清FBG、TC、TG和HDL-C水平的比較

2 各組大鼠心臟功能的變化

與control組和DM-S組相比，DM+MIRI組的HR和LVEDP升高，MAP、LVSP和LVEF降低(P<0.05)；與DM+MIRI組相比，益氣養(yǎng)陰方各組和bardoxolone methyl組的HR和LVEDP降低，MAP、LVSP和LVEF升高(P<0.05)，見圖2。

3 血清cTnI、TNF-α、IL-1β和IL-10水平的比較

與control和DM-S組相比，DM+MIRI組的cTnI、TNF-α、IL-1β和IL-10水平升高(P<0.05)；與DM+MIRI組相比，益氣養(yǎng)陰方各組和bardoxolone methyl組的cTnI、TNF-α、IL-1β和IL-10水平降低(P<0.05)，見圖3。

4 各組大鼠心肌梗死體積的變化

與control和DM-S組相比，DM+MIRI組的心肌梗死體積百分比升高(P<0.05)；與DM+MIRI組相比，益氣養(yǎng)陰方各組和bardoxolone methyl組的心肌梗死體積百分比降低(P<0.05)，見圖4。

Figure 2. Comparison of the cardiac functions of the rats in each group. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDM-S group;#P<0.05vsDM+MIRI group.

圖2 各組大鼠心臟功能的變化情況比較

Figure 3. Comparison of the serum levels of cTnI, TNF-α, IL-1β and IL-10 in each group. Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDM-S group;#P<0.05vsDM+MIRI group.

圖3 各組血清CTnI、TNF-α、IL-1β和IL-10水平的比較

Figure 4. Assessment of myocardial infarction volume in the rats by TTC staining and comparison of the quantitative analysis data in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDM-S group;#P<0.05vsDM+MIRI group.

圖4 TTC染色評價各組大鼠心肌梗死體積的變化

5 大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化的觀察

HE染色結(jié)果顯示，control組和DM-S組大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列緊密，纖維結(jié)構(gòu)排列規(guī)則；DM+MIRI組大鼠心肌細(xì)胞破碎、壞死，細(xì)胞排列不規(guī)則，心肌纖維斷裂，伴有炎性細(xì)胞浸潤；TL組、TM組、TH組和bardoxolone methyl組可見破碎和壞死心肌細(xì)胞有所減少，纖維斷裂減少，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，見圖5。

6 大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況的比較

與control和DM-S組相比，DM+MIRI組心肌細(xì)胞的凋亡率升高(P<0.05)；與DM+MIRI組相比，益氣養(yǎng)陰方各組和bardoxolone methyl組心肌細(xì)胞的凋亡率均降低(P<0.05)，見圖6。

7 大鼠心肌組織中p-ERK1/2、Nrf2和HO-1蛋白水平的變化

與control和DM-S組相比，DM+MIRI組p-ERK1/2、Nrf2和HO-1的蛋白水平均降低(P<0.05)；與DM+MIRI組相比，益氣養(yǎng)陰方各組和bardoxolone methyl組p-ERK1/2、Nrf2和HO-1的蛋白水平均升高，見圖7。

Figure 5. Assessment of myocardial pathomorphological changes in the rats by HE staining (×200).

圖5 HE染色評價大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化

8 各組心肌組織中SOD活性及MDA和ROS水平的變化情況

與control和DM-S組相比，DM+MIRI組MDA和ROS水平均升高，SOD活性降低(P<0.05)；與DM+MIRI組相比，益氣養(yǎng)陰方各組和bardoxolone methyl組MDA和ROS水平均降低，SOD活性升高(P<0.05)，見圖8。

討 論

本研究首先制備DM大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與control組相比，DM-S組FBG、TC和TG水平均升高，HDL-C水平降低，表明DM大鼠血糖血脂水平均升高，符合DM病變特征，提示DM大鼠模型復(fù)制成功[7]。進(jìn)一步結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支近端制備MIRI模型發(fā)現(xiàn)，與DM-S組相比，DM+MIRI組HR和LVEDP升高，MAP、LVSP和LVEF降低，血清炎癥因子水平升高，大鼠心肌組織梗死區(qū)域體積比增加，心肌細(xì)胞破碎、壞死增多伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，表明結(jié)扎法能夠成功復(fù)制MIRI模型，引發(fā)大鼠心肌損傷，提示DM+MIRI模型復(fù)制成功。

益氣養(yǎng)陰方由人參、黃芪、山藥、丹參、黃精和當(dāng)歸等組成。藥理研究顯示，人參能夠降糖降脂；黃芪具有雙向調(diào)節(jié)血糖的作用，還能夠降低糖尿病患者的血液黏度，保護(hù)患者內(nèi)皮細(xì)胞；丹參、當(dāng)歸可祛癖止痛、活血通經(jīng)，緩解心絞痛，改善心肌缺血等[8]。牛新萍等[9]研究發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰方可改善心肌梗死患者心功能，降低炎癥反應(yīng)。益氣養(yǎng)陰活血方能夠通過激活PI3K-Akt通路緩解大鼠離體心臟缺血再灌注損傷[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與DM+MIRI組相比，益氣養(yǎng)陰方各組HR和LVEDP降低，MAP、LVSP和LVEF升高，血清cTnI、TNF-α、IL-1β和IL-10水平降低，心肌梗死體積百分比降低，大鼠心肌細(xì)胞破碎、壞死減少，提示益氣養(yǎng)陰方可通過減輕DM+MIRI大鼠心肌損傷，降低其血糖水平，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，然而其具體機(jī)制目前尚不清楚。

心肌組織損傷是由多因素共同作用的結(jié)果，較多研究顯示MIRI與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，機(jī)體正常狀態(tài)下，細(xì)胞凋亡主要發(fā)揮清除衰老及病變細(xì)胞，維持機(jī)體健康的作用；當(dāng)機(jī)體遭受外界、內(nèi)部刺激或病理損傷后，細(xì)胞失去對其生長和凋亡的正常調(diào)控，凋亡過程出現(xiàn)紊亂，引發(fā)細(xì)胞異常凋亡，最終導(dǎo)致組織發(fā)生病理性損傷[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與control和DM-S組相比，DM+MIRI組心肌細(xì)胞凋亡率升高，益氣養(yǎng)陰方處理后心肌細(xì)胞凋亡率降低，提示益氣養(yǎng)陰方可有效抑制DM合并MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

Figure 6. The images of TUNEL staining (×100) for observing the cardiomyocyte apoptosis in the rats and the quantitative analysis of the apoptotic rates in the rats of different groups. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDM-S group;#P<0.05vsDM+MIRI group.

圖6 TUNEL法觀察各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況

ERK1/2信號通路為MAPK家族中重要亞族，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。大量研究表明ERK1/2信號通路在MIRI激活/抑制中發(fā)揮重要作用[13]。ERK1/2一般在心肌細(xì)胞中呈低表達(dá)，當(dāng)受到MIRI刺激后被激活發(fā)生磷酸化。蔣智等[14]研究發(fā)現(xiàn)EdCC通過激活ERK1/2信號通路緩解小鼠MIRI，其機(jī)制可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。Nrf2/ARE通路為重要抗氧化應(yīng)激通路，近期在腦缺血再灌注損傷中發(fā)現(xiàn)ERK1/2信號通路活化后可改變Nrf2構(gòu)象，進(jìn)而激活Nrf2導(dǎo)致Nrf2與Keap1解離，且活化Nrf2，進(jìn)入細(xì)胞核中與Are結(jié)合，調(diào)控抗氧化蛋白如HO-1和NQO1蛋白等發(fā)揮抗氧化作用[15]。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注損傷后，激活ERK1/2后ERK1/2發(fā)生磷酸化可進(jìn)一步活化Nrf2/HO-1抗氧化通路，進(jìn)而減少腦神經(jīng)毒性損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與control和DM-S組相比，DM+MIRI組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)降低，ERK1/2磷酸化水平降低，益氣養(yǎng)陰方處理后Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)均升高，ERK1/2磷酸化水平升高，且與bardoxolone methyl組作用一致，提示ERK/Nrf2/HO-1通路參與MIRI，且益氣養(yǎng)陰方可通過激活ERK/Nrf2/HO-1通路緩解大鼠MIRI，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。另外，本研究結(jié)果還顯示，與control和DM-S組相比，DM+MIRI組心肌組織MDA和ROS水平均升高，SOD水平降低；給予益氣養(yǎng)陰方后，MDA和ROS水平均降低，SOD水平升高。這提示益氣養(yǎng)陰方可減少MIRI引發(fā)的氧自由基堆積，發(fā)揮抗氧化作用，由此推測益氣養(yǎng)陰方可緩解MIRI引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷。

Figure 7. The images of Western blot for determining the protein levels of p-ERK1/2, Nrf2 and HO-1 in each group and the results of quantitative analysis. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDM-S group;#P<0.05vsDM+MIRI group.

圖7 Western blot檢測各組大鼠心肌p-ERK1/2、Nrf2和HO-1蛋白水平的變化

Figure 8. The myocardial levels of SOD, MDA and ROS in the rats of each group. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsDM-S group;#P<0.05vsDM+MIRI group.

圖8 各組大鼠心肌組織SOD活力及MDA和ROS水平的變化

綜上所述，益氣養(yǎng)陰方可能通過激活ERK/Nrf2/HO-1通路，減輕MIRI引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究也存在一定的缺陷，氧化應(yīng)激指標(biāo)過少，此外DM合并MIRI發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，是否還有其它信號通路參與益氣養(yǎng)陰方對MIRI的作用，還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。