消腫止痛合劑通過VEGF-Dll4/Notch信號通路減輕大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷*

劉 濤， 何志軍， 宋 淵， 李 巖， 陳 文， 李金鵬， 姚興璋

(甘肅省中醫(yī)院， 甘肅 蘭州 730050)

皮瓣移植通常用于修復(fù)外傷、先天性缺陷、腫瘤切除或其它原因造成的傷口。局部皮瓣壞死是臨床常見問題，尤其是皮瓣遠(yuǎn)端[1-2]。皮瓣壞死主要由血液灌注不足或再灌注損傷引起，并造成組織和血管的一些有害變化。常見的缺血因素，如手術(shù)技術(shù)和處理不當(dāng)、吸煙和糖尿病，可能會危及皮瓣的生存。壞死皮瓣的處理非常耗時，需要反復(fù)更換敷料，甚至需要二次重建手術(shù)[3-4]。因此，尋找更好的藥物和方法，改善皮瓣血管內(nèi)皮細(xì)胞功能是提高皮瓣成活率的重中之重。中醫(yī)藥已經(jīng)在臨床廣泛應(yīng)用于治療各種缺血性疾病，但對皮瓣缺血壞死目前基礎(chǔ)研究較少[5]。本實驗觀察了消腫止痛合劑對體外培養(yǎng)大鼠皮瓣血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-Delta樣配體4 (Delta-like ligand 4, Dll4)/Notch信號通路的影響，以期了解消腫止痛合劑的作用機制并對臨床做出指導(dǎo)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及藥品

SD雌性大鼠3只，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物SPF級實驗中心，許可證號為SCXK(甘)2017-0025。 消腫止痛合劑由甘肅省中醫(yī)院制劑科生產(chǎn)，生產(chǎn)批號為20051122。

2 試劑與儀器

抗VEGF-A、Notch和Dll4抗體(Abcam)；抗β-actin 抗體(Bioworld)；VEGF受體抑制劑axitinib和Notch通路阻斷劑MK-0752(Selleck)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗(中山金橋)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 蛋白裂解液、5×SDS 上樣緩沖液和脫脂奶粉(索萊寶)；PI染料(Sigma)。倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡(OLYMPUS)； 電泳儀和酶標(biāo)儀(Bio-Bad)；紫外分光光度計和CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)； 臺式高速冷凍離心機(Heraeus)；實時熒光定量PCR儀(ABI)。

3 方法

3.1大鼠皮瓣血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取200 g 左右的SD大鼠3只，用10%的水合氯醛麻醉并脫頸處死后，浸泡于75%的乙醇30 min。于背部皮下切取血管蒂末端及其長入?yún)^(qū)，得到血管組織并將其剪為約1 mm×1 mm的碎塊，置于無菌PBS緩沖液中清洗3次。將血管組織置于培養(yǎng)瓶中，加入5 mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴消化15 min后，棄去上清液，沉淀用無菌PBS清洗3次后，加入0.1%的Ⅱ型膠原酶5 mL，37 ℃水浴消化15 min后，收集上清液并加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。向沉淀中加入0.1%的Ⅱ型膠原酶5 mL，重復(fù)上述消化過程并收集合并消化液。將收集的消化液于200目細(xì)胞篩過濾，將濾液于1 000 r/min離心10 min后，棄去上清并利用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞置于10 cm培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。每3 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后進(jìn)行傳代培養(yǎng)[6]。

3.2消腫止痛合劑最佳藥物濃度篩選 將消腫止痛合劑利用PBS稀釋后制備成藥物原液，利用0.2 μm的細(xì)胞濾器過濾除菌后，以103、104、105、106和107倍稀釋至終濃度，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，藥物處理細(xì)胞1 d、3 d、6 d和9 d后，利用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，進(jìn)而獲得最佳藥物處理濃度。

3.3分組、給藥與造模 將細(xì)胞分為對照(control)組、缺氧(hypoxia)組、缺氧+消腫止痛劑組(hypoxia+detumescence組)、缺氧+消腫止痛劑+axitinib組(hypoxia+detumescence+AXI組)及缺氧+消腫止痛劑+MK-0752組(hypoxia+detumescence+MK組)。對照組細(xì)胞以常氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)；其它各組放置于三氣培養(yǎng)箱中，持續(xù)95% N2和5% CO2混合氣體進(jìn)行缺氧處理[7]。缺氧及藥物處理不同時間后，進(jìn)行后續(xù)實驗研究。

3.4ELISA檢測 分別設(shè)正常組、缺氧組、缺氧+消腫組、缺氧+消腫+AXI組和缺氧+消腫+MK組。將細(xì)胞以1×108/L接種于6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，加入相應(yīng)濃度的藥物及阻斷劑后，將細(xì)胞置于低氧環(huán)境中進(jìn)行缺氧處理，分別處理6 h、12 h、24 h和48 h后，取出細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，無菌PBS清洗3次后，每皿加入300 μL含PMSF抑制劑的蛋白RIPA裂解液，置于冰板上裂解5 min后， 12 000 r/min、 4 ℃ 離心30 min，小心地吸取收集上清液并轉(zhuǎn)入新EP管中，BCA法測定總蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度為一致后，按照ELISA檢測說明書進(jìn)行操作。

3.5死細(xì)胞與活細(xì)胞的檢測方法 為了判斷缺氧對血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響，及檢測消腫止痛合劑對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，采用細(xì)胞calcein-AM和PI雙染色法判斷缺氧后死活細(xì)胞數(shù)量。calcein-AM的乙酸甲基酯親脂性很高，使其可透過細(xì)胞膜，通過活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用，calcein-AM能脫去AM基，產(chǎn)生的calcein(鈣黃綠素)能發(fā)出強綠色熒光，因此calcein-AM僅對活細(xì)胞染色；另一方面，作為核染色染料的PI不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，它穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光，因此PI僅對死細(xì)胞染色。具體操作過程如下：分別設(shè)對照組、缺氧組、缺氧+消腫組、缺氧+消腫+AXI組和缺氧+消腫+MK組。將細(xì)胞以1×108/L接種于6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，加入相應(yīng)濃度的藥物及阻斷劑后，將細(xì)胞置于低氧環(huán)境中進(jìn)行缺氧處理，分別處理6 h、12 h、24 h和48 h后，取出細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶1 mL收集細(xì)胞，1 000 r/min離心后，棄去胰酶，加入PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108/L，取細(xì)胞懸浮液1 mL后，加入calcein-AM和PI染液，37 ℃孵育30 min后，取染液50 μL滴于載玻片后，加蓋蓋玻片封片后，置于熒光顯微鏡檢測?；罴?xì)胞為綠色，死亡細(xì)胞為紅色，統(tǒng)計后計算細(xì)胞死亡率。

3.6Western blot實驗 分別設(shè)對照組、缺氧組、缺氧+消腫組、缺氧+消腫+AXI組和缺氧+消腫+MK組。將細(xì)胞以1×108/L接種于6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，加入相應(yīng)濃度的藥物及阻斷劑后，將細(xì)胞置于低氧環(huán)境中進(jìn)行缺氧處理，分別處理6 h、12 h、24 h和48 h后，取出細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，無菌PBS清洗3次后，每皿加入300 μL含PMSF抑制劑的蛋白RIPA裂解液，置于冰板上裂解5 min后， 12 000 r/min 4 ℃ 離心30 min，小心地吸取收集上清液并轉(zhuǎn)入新EP管中，BCA法測定總蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度結(jié)果調(diào)整蛋白濃度為一致后，向已提取的蛋白中加入1×上樣緩沖液，沸水浴10 min。各組取含20 μg蛋白質(zhì)樣品，12% SDS-PAGE分離蛋白后， 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入5%的脫脂奶粉封閉2 h，孵育抗VEGFA抗體(1∶1 000)、抗DLL4抗體(1∶1 000)、抗Notch-1抗體(1∶1 000)和抗β-actin抗體(1∶2 000)，4 ℃過夜。次日用4 ℃預(yù)冷的TBST搖床漂洗4次，每次8 min，加入相應(yīng)的 II 抗(1 ∶1 000稀釋)后，室溫?fù)u床孵育1.5 h，利用 TBST漂洗4次，每次8 min，加入發(fā)光液1 min后，將PVDF膜進(jìn)行曝光，所得圖片采用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行掃描，利用β-actin校準(zhǔn)后計算相應(yīng)的灰度值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間是否存在差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析，方差齊者兩組間的差異比較用SNK-q檢驗，方差不齊者兩組間的差異比較用Dunnett’s 檢驗法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 缺氧處理后細(xì)胞內(nèi)VEGF含量檢測結(jié)果

缺氧處理6 h和12 h后細(xì)胞內(nèi)VEGF含量的差異并無統(tǒng)計學(xué)顯著性，然而與對照組相比,當(dāng)缺氧24 h和48 h后，細(xì)胞內(nèi)的VEGF含量顯著增加(P<0.05)。當(dāng)加入消腫止痛合劑后，VEGF含量進(jìn)一步增加，且顯著高于缺氧組(P<0.05)。當(dāng)加入VEGF阻斷劑后，消腫止痛合劑引起的VEGF含量增加的趨勢被有效抑制，缺氧+消腫+AXI組的VEGF含量顯著低于缺氧+消腫組(P<0.05)；當(dāng)加入Notch阻斷劑后，消腫止痛合劑引起VEGF增加的趨勢更加明顯，然而，缺氧+消腫組與缺氧+消腫+MK組之間的差異并無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1。

2 缺氧處理后死細(xì)胞與活細(xì)胞染色的檢測結(jié)果

缺氧處理1 d后，與對照組相比，缺氧處理組死亡細(xì)胞的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；其它各組死亡的細(xì)胞與對照組比較差異也無統(tǒng)計學(xué)顯著性。缺氧處理2 d后，與對照組相比，缺氧組細(xì)胞的死亡率顯著增加(P<0.05)；與缺氧組相比，缺氧+消腫組細(xì)胞的死亡率顯著降低(P<0.05)。缺氧處理3 d后，缺氧引起的細(xì)胞死亡進(jìn)一步增加(P<0.05)，與缺氧組相比，缺氧+消腫組的細(xì)胞死亡率顯著降低(P<0.05)；當(dāng)利用VEGF阻斷劑處理后，消腫止痛合劑緩解細(xì)胞死亡的能力被阻斷，與缺氧+消腫組相比，缺氧+消腫+AXI組的細(xì)胞死亡率顯著增加(P<0.05)。當(dāng)利用Notch阻斷劑處理后，消腫止痛合劑緩解細(xì)胞死亡的能力有進(jìn)一步增強的趨勢，然而與缺氧+消腫組相比，缺氧+消腫+MK組的細(xì)胞死亡率差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖2～5。

3 缺氧處理后Western blot檢測結(jié)果

缺氧24 h后，缺氧后細(xì)胞內(nèi)VEGF-A、Notch和Dll4 的蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)，當(dāng)利用消腫止痛合劑處理后，VEGF-A、Notch和Dll4的表達(dá)量進(jìn)一步增加(P<0.05)。然而，當(dāng)加入VEGF抑制劑后，消腫止痛合劑引起的VEGF-A、Notch和Dll4表達(dá)增加的趨勢被顯著抑制(P<0.05)；當(dāng)加入Notch抑制劑后，消腫止痛合劑引起的VEGF-A 表達(dá)增加的趨勢更加明顯，Notch和Dll4表達(dá)增加的趨勢被有效抑制(P<0.05)。缺氧處理48 h后VEGF-A、Notch和Dll4表達(dá)量的結(jié)果與24 h類似，見圖6、7。

Figure 1. Detection of intracellular VEGF content after hypoxia treatment. Mean±SD．n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vshypoxia group;&P<0.05vshypoxia+detumescence group.

圖1 缺氧處理后細(xì)胞內(nèi)VEGF含量檢測結(jié)果

Figure 2. The staining results of dead and living cells 1 d after hypoxia treatment showed that the green cells were calcein-AM stained viable cells and the red cells were PI stained dead cells with a scale of 100 μm.

圖2 缺氧處理1 d后死細(xì)胞與活細(xì)胞的染色結(jié)果

討 論

皮瓣移植技術(shù)作為顯微外科和矯形外科手術(shù)中重要的技術(shù)之一，可以有效解決皮膚大面積缺損，如開放性傷口皮膚缺損的覆蓋，腫瘤切除后大創(chuàng)口的修復(fù)、骨髓炎以及畸形的治療[7]。皮瓣的缺血再灌注損傷會導(dǎo)致其壞死，損傷模式復(fù)雜，涉及氧自由基的形成、血小板聚集、凋亡和白細(xì)胞/內(nèi)皮相互作用，自由基誘導(dǎo)的凋亡和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致壞死的主要原因。減輕缺血缺氧后血管內(nèi)皮損傷是防治皮瓣壞死的重要手段，也是中藥治療皮瓣壞死的作用靶點[8-9]。

消腫止痛合劑為甘肅省中醫(yī)院內(nèi)制劑，由李盛華教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗研制，已在臨床應(yīng)用多年[10]，由川芎、桃仁、紅花、赤芍、生地、當(dāng)歸、三七、木香、青皮和澤蘭等組成。方中君藥當(dāng)歸、川芎活血祛瘀，消腫止痛，配桃仁、紅花加強其破瘀血、生新血之力，共為臣藥[11-12];合三七加強行瘀、鎮(zhèn)痛、消腫功效;理血必先行血，氣行則血行，故配合青皮、木香行氣散結(jié)止痛，上三味共為佐藥;輔生地、赤芍涼血消瘀。損傷早期組織處痙攣疼痛，有滲出、水腫病理變化，故配澤蘭消散癰腫，減少其滲出，促使腫脹消退，諸藥合用，共奏活血化瘀、消腫止痛之功。組方中的川芍、紅花、赤芍和三七等藥物均有單體實驗研究證明對血管有保護(hù)作用并具有抗凝作用，有研究證明川芎提取物川芎嗪可擴張血管、增加冠脈血流及腦血流、抑制血小板聚集和降低血小板活性，為一種鈣拮抗劑。

Figure 3. The staining results of dead and living cells after 2 d of hypoxia treatment showed that the green was calcein-AM stained viable cells and the red was PI stained dead cells with a scale of 100 μm.

圖3 缺氧處理2 d后死細(xì)胞與活細(xì)胞的染色結(jié)果

Figure 4. The staining results of dead and living cells after 3 d of hypoxia treatment showed that the green was calcein-AM stained viable cells and the red was PI stained dead cells with a scale of 100 μm.

圖4 缺氧處理3 d后死細(xì)胞與活細(xì)胞的染色結(jié)果

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)最強的促血管再生的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)缺血皮瓣的血運重建，從而提高皮瓣的存活率。在皮瓣中，VEGF由角質(zhì)形成細(xì)胞和表皮成纖維細(xì)胞分泌，在皮膚血管結(jié)構(gòu)中尤其活躍。此外，低氧角質(zhì)形成細(xì)胞合成編碼VEGF-121和VEGF-156的mRNAs，這些可溶性亞型通過幾個細(xì)胞層和基底層擴散到目標(biāo)(真皮血管內(nèi)皮表面的受體)。Notch信號通路能夠調(diào)控和維持正常胚胎發(fā)育組織穩(wěn)態(tài)以及成體組織中的干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路在內(nèi)皮細(xì)胞特化為頂端細(xì)胞和柄細(xì)胞的過程中起到重要調(diào)控作用[13-14]。Notch信號通路由細(xì)胞膜上表達(dá)的Notch受體、Notch配體(Dll4)及下游信號分子組成。Notch在柄細(xì)胞中的活性很高，而在頂端細(xì)胞中呈低水平表達(dá)；相反，Dll4在頂端細(xì)胞中表達(dá)較高。在血管生成中VEGF作為關(guān)鍵驅(qū)動因素，而 Notch信號有助于適當(dāng)?shù)貐f(xié)調(diào)響應(yīng)[15-17]。作為血管形成正向調(diào)節(jié)因子的VEGF，通過誘導(dǎo)VEGF-A的表達(dá)而啟動Dll4/Notch信號作為負(fù)反饋調(diào)節(jié)因素，有效預(yù)防過量血管的形成，因此，血管再生是在VEGF和Dll4/Notch信號系統(tǒng)的協(xié)同作用下共同完成的結(jié)果[18-19]。本研究結(jié)果表明，消腫止痛合劑可以明顯上調(diào)VEGF-A、Notch和Dll4 mRNA的表達(dá)，激活VEGF-Dll4/Notch信號通路，降低細(xì)胞死亡率；為了證實消腫止痛合劑是通過VEGF-Dll4/Notch信號通路減輕缺氧所致大鼠皮瓣血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，實驗進(jìn)一步采用VEGF受體抑制劑和Notch通路阻斷劑干預(yù)細(xì)胞，結(jié)果顯示，VEGF受體抑制劑可引起VEGF-A、Notch和Dll4蛋白表達(dá)增加的抑制，Notch通路阻斷劑引起Notch和Dll4蛋白表達(dá)增加的趨勢被有效抑制，VEGF-A蛋白表達(dá)繼續(xù)增加。這些結(jié)果表明，消腫止痛合劑可顯著增加細(xì)胞內(nèi)VEGF的含量，從而在缺氧環(huán)境中對血管內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用，然而VEGF進(jìn)一步增加會引起細(xì)胞內(nèi)Dll4-Noth含量的增加，進(jìn)而抑制VEGF過度表達(dá)，引起血管過度生長。因此，調(diào)控VEGF-Dll4/Notch通路各分子的表達(dá)成為皮瓣缺血治療的一種新途徑[20]。

Figure 5. Statistical results of dead cells after hypoxia treatment. Mean±SD．n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vshypoxia group;&P<0.05vshypoxia+detumescence group.

圖5 缺氧處理后死細(xì)胞的統(tǒng)計結(jié)果

Figure 6. The protein expression of VEGF-A, Notch and Dll4 in cells after 24 h of hypoxia treatment. Mean±SD．n=3．*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vshypoxia group;&P<0.05vshypoxia+detumescence group.

圖6 缺氧處理24 h后細(xì)胞VEGF-A、Notch和Dll4蛋白表達(dá)結(jié)果

Figure 7. The protein expression of VEGF-A, Notch and Dll4 in cells after 48 h of hypoxia treatment. Mean±SD.n=3．*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vshypoxia group;&P<0.05vshypoxia+detumescence group.

圖7 缺氧處理48 h后細(xì)胞VEGF-A、Notch和Dll4蛋白表達(dá)結(jié)果

本實驗結(jié)果顯示，消腫止痛合劑能減輕由缺氧所致大鼠皮瓣血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡，上調(diào)VEGF-A、Notch和Dll4的蛋白表達(dá)，推測其可能是通過調(diào)控VEGF-Dll4/Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮治療作用。其具體作用機制還有待進(jìn)一步研究。