養(yǎng)陰口香合劑中枳殼的質(zhì)量控制研究*

郭璐玫，劉興鵬△，陳文碧，姜 蓮，陳 鳳

（1. 貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽550004； 2. 貴州萬順堂藥業(yè)有限公司，貴州 貴陽550018）

養(yǎng)陰口香合劑為傳統(tǒng)中藥方劑，已被收載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科脾胃分冊(cè)。它由石斛、枳殼、茵陳、黃芩、藍(lán)布正、龍膽、麥冬、天冬、枇杷葉、黃精、生地黃、朱砂根12 味藥材組成，具有清胃瀉火，滋陰生津，行氣消積之功效。全方組織配伍開合相濟(jì)，生機(jī)靈動(dòng)，滋陰而不呆滯，祛邪留有出路。煩熱多屬于虛，以地黃、麥冬、天冬、石斛、黃精清熱滋陰藥之甘，治腎胃之虛熱，瀉而兼補(bǔ)也；茵陳、黃芩之苦寒折熱而去濕；火熱上行為患，故又以枳殼、枇杷葉抑而降之[1]。

傳統(tǒng)中醫(yī)將養(yǎng)陰口香合劑用于胃熱津虧，陰虛郁熱上蒸所致的口臭，口舌生瘡，齒齦腫痛，咽干口苦，胃灼熱痛，腸燥便秘[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)將其用于治療慢性萎縮性胃炎，對(duì)急性胰島素抵抗小鼠胰島素敏感指數(shù)的影響等方面的研究有文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]。

枳殼是養(yǎng)陰口香合劑中主降胃氣的主要藥味，歸脾、胃經(jīng)，能理氣寬中，行氣消滯[5]。枳殼為傳統(tǒng)中醫(yī)藥中常用的中藥之一，使用已有數(shù)千年的歷史。近年來體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明枳殼不同部位具有調(diào)節(jié)胃腸功能[6]、抗凝血[7]、抗抑郁[8]、抗缺血[9]、降低門脈高壓[10]和免疫調(diào)節(jié)[11]等藥理學(xué)作用。

傳統(tǒng)中藥已經(jīng)在我國(guó)臨床應(yīng)用了數(shù)千年。由于其獨(dú)特的理論和悠久的臨床實(shí)踐，在世界范圍內(nèi)受到越來越多的關(guān)注。但不可控制的質(zhì)量是制約傳統(tǒng)中藥現(xiàn)代化和全球化的瓶頸[12]。目前，在養(yǎng)陰口香合劑質(zhì)量控制中，缺少對(duì)枳殼的質(zhì)量控制現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)。因此，本實(shí)驗(yàn)研究旨為生產(chǎn)企業(yè)和管理部門對(duì)其質(zhì)量控制制定現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，提高對(duì)養(yǎng)陰口香合劑的質(zhì)量控制，保證藥品質(zhì)量和臨床療效，提高技術(shù)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ThermoFisher Ultimate3000（DAD）液相色譜儀；CAMAG 薄層點(diǎn)樣儀；瑞士梅特勒托利多AE200 型（十萬分之一）和XP26 型（百萬分之一）電子天平；millipore 超純水機(jī)制備超純水。

1.2 材料 養(yǎng)陰口香合劑（貴州萬順堂藥業(yè)有限公司）；柚皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110722-201815，含量以91.7%計(jì)）；新橙皮苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111857-201102，含量以99.6%計(jì)）；枳殼對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120981-201605）；乙腈為色譜純；超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 枳殼的TLC 定性鑒別 本實(shí)驗(yàn)以枳殼對(duì)照藥材為指標(biāo)物質(zhì)，建立養(yǎng)陰口香合劑中枳殼的薄層色譜鑒別方法。

2.1.1 供試品溶液的制備[13]取本品10 mL，用乙酸乙酯提取2 次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)靡掖? mL 使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 缺枳殼陰性對(duì)照品溶液的制備 按處方比例稱取除枳殼外其他藥材，制成缺枳殼的陰性樣品，同“2.1.1”項(xiàng)下方法制備缺枳殼的陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 枳殼對(duì)照藥材溶液的制備 取枳殼對(duì)照藥材1 g，加水20 mL，加熱回流1 h，用脫脂棉過濾，濾液置分液漏斗中，同“2.1.1”項(xiàng)下方法制得枳殼對(duì)照藥材溶液。

2.1.4 TLC 色譜條件及檢視方法 照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 板上，以二氯甲烷-甲醇-水（10 ∶6 ∶2）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液，置日光下檢視。

2.1.5 枳殼TCL 鑒別結(jié)果 供試品色譜中，在與枳殼對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色斑點(diǎn)，且缺枳殼的陰性對(duì)照品無干擾（圖1）。

圖1 TCL 方法對(duì)養(yǎng)陰口香合劑中枳殼的定性鑒別

2.2 枳殼含量的HPLC 測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)參照現(xiàn)行藥典中枳殼的含量測(cè)定，選取柚皮苷和新橙皮苷為指標(biāo)成分，建立養(yǎng)陰口香合劑中枳殼的含量測(cè)定[14]。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Xbridge C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－水[14]（20 ∶80）；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)，應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取柚皮苷和新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%乙醇溶液制成每1 mL含柚皮苷30 μg、新橙皮苷15 μg 的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，混勻，精密量取2 mL，置50 mL 量瓶中，加50%乙醇適量，振搖使之混勻并定容到刻度，搖勻后過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL 量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm 的濾頭濾過，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備 取缺枳殼陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照品溶液，即得。

2.2.5 專屬性考察 取混合對(duì)照品溶液、養(yǎng)陰口香合劑供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，供試品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有相應(yīng)的色譜峰，且陰性無干擾，見圖2。

圖2 養(yǎng)陰口香合劑中枳殼含量HPLC 測(cè)定

2.2.6 線性關(guān)系考察[15]精密取混合對(duì)照品溶液2 μL，5 μL，7 μL，10 μL，15 μL，20 μL，25 μL依次注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，繪制工作曲線，得出線性回歸方程為：柚皮苷y=1，814.6054 x + 0.8978，r=0.9999，在0.05680 μg～0.7100 μg 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；新橙皮苷y=3375.1357x+0.8978，r=0.9999，在0.03053 μg～0.3817 μg 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖峰面積，柚皮苷對(duì)照品的峰面積RSD 為0.1%，新橙皮苷對(duì)照品的峰面積RSD 為0.1%，結(jié)果說明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批養(yǎng)陰口香合劑，按“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6 份，按“2.2.1”色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果測(cè)得柚皮苷的平均含量為3.1306 mg/mL，RSD%為0.3%，新橙皮苷的平均含量為1.7753 mg/mL，RSD%為0.3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取養(yǎng)陰口香合劑供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，于0 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h，測(cè)定峰面積，柚皮苷的RSD%為0.2%，新橙皮苷的RSD%為0.3%，說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 回收率試驗(yàn)[16]取已測(cè)定含量的養(yǎng)陰口香合劑（柚皮苷含量3.1306 mg/mL，新橙皮苷含量1.7753 mg·mL-1）1 mL，置50 mL 量瓶中，精密加入柚皮苷和新橙皮苷混合對(duì)照品溶液（含柚皮苷0.1245 mg·mL-1、含新橙皮苷0.07236 mg·mL-1）25 mL，振搖混勻，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并按“2.2.1”色譜條件測(cè)定柚皮苷和新橙皮苷的含量，計(jì)算各自成分的回收率，見表1 和表2，說明有較好回收率。

表1 柚皮苷回收率試驗(yàn)（n=6）

表2 新橙皮苷回收率試驗(yàn)（n=6）

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取15 批養(yǎng)陰口香合劑，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果（n=15）

3 討論

3.1 枳殼的TLC 定性鑒別 本實(shí)驗(yàn)供試品溶液的制備對(duì)比了取樣品蒸干后直接用甲醇溶解[14]和取樣品用乙酸乙酯萃取，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取的供試品溶液易點(diǎn)樣，展開后斑點(diǎn)圓整無拖尾。展開劑對(duì)比了二氯甲烷-甲醇-水（13 ∶6 ∶2）的下層溶液和正己烷-乙酸乙酯（2 ∶3）[17]，顯示前者的分離效果較好。顯色方式對(duì)比了噴以3%三氯化鋁乙醇溶液和5%三氯化鐵乙醇[18]溶液，結(jié)果后者斑點(diǎn)清晰無干擾。

3.2 枳殼含量的HPLC 測(cè)定 枳殼的HPLC 含量測(cè)定研究中，取對(duì)照品溶液在200～400nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描波長(zhǎng)，柚皮苷和新橙皮苷在283nm 處均有最大吸收，且分離度較好，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為283nm。研究比較了乙腈-水（20 ∶80）、乙腈-0.1%磷酸溶液（20 ∶80）[19]與甲醇-0.3%乙酸[20]的洗脫效果，結(jié)果乙腈-水（20 ∶80）為流動(dòng)相的峰型和分離度較好，且簡(jiǎn)便，故采取乙腈-水（20 ∶80）作為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)還研究了供試品的提取溶劑，采用水、甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇對(duì)養(yǎng)陰口香合劑進(jìn)行提取，結(jié)果表明，以50%乙醇為溶劑，峰形好，雜峰較少，分離度好，提取效率較高，故選用50%乙醇為提取溶劑。本研究結(jié)果表明采用高效液相色譜測(cè)定柚皮苷對(duì)照品在0.05680 μg ～0.7100 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999），平均回收率為100.21%；新橙皮苷對(duì)照品在0.03053 μg ～0.3817 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999），平均回收率為98.33%。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)養(yǎng)陰口香合劑中枳殼的質(zhì)量控制研究所采用的TLC 鑒別及HPLC 含量測(cè)定，方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、簡(jiǎn)便易行，能夠較全面、可靠地控制養(yǎng)陰口香合劑中枳殼的質(zhì)量，為生產(chǎn)企業(yè)和管理部門鑒定、檢測(cè)和制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。