基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的中醫(yī)方劑治療肺癌核心藥物及其干預(yù)靶點(diǎn)分析*

喬 陽，劉 震，郭利平△，李 博，任 明

（1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬?？滇t(yī)院，天津300193）

在過去幾十年中，肺癌一直是世界各個(gè)地區(qū)癌癥死亡的主要原因，根據(jù)中國國家癌癥中心于2018 年2 月發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，肺癌是全國惡性腫瘤發(fā)病率以及惡性腫瘤導(dǎo)致死亡人數(shù)最高的腫瘤，同時(shí)根據(jù)2019 年最新發(fā)布的美國癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告及預(yù)測模型顯示，肺癌發(fā)病人數(shù)是所有新發(fā)病例人數(shù)第二高的腫瘤，其死亡人數(shù)將比因患乳腺癌、前列腺癌、大腸癌以及白血病的死亡人數(shù)相加總和更高[1]。盡管新的血液療法和細(xì)胞免疫療法有一定進(jìn)展，但主要的治療方案依舊局限于手術(shù)切除以及放化療（ALA 2015），同時(shí)并沒有觀察到肺癌患者的預(yù)后獲得明顯的改善。

中醫(yī)療法常用來改善西醫(yī)療法對肺癌患者的副作用，特別是那些接受聯(lián)合化療和放療的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的患者。據(jù)報(bào)道，中醫(yī)治療肺癌的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)肺癌患者的免疫功能，增強(qiáng)T 細(xì)胞遷移活動(dòng)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑[2-4]。

在既往的研究中我們發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥療法可有效提高肺癌生存周期，對肺癌具有一定靶向效應(yīng)和確切的療效，許多肺系疾病經(jīng)典方劑對肺癌的治療有明顯作用，如玉屏風(fēng)散、四君子湯等。有研究表明，通過服用四君子湯可有效緩解肺癌癥狀，改善患者生活質(zhì)量[5]。治療肺癌的中藥方劑使用藥物廣泛博雜，然而其配伍規(guī)律以及核心藥物尚不明確，同時(shí)既往對肺癌治療方藥的數(shù)據(jù)挖掘研究多從中醫(yī)治療“理法方藥”的層面上分析藥物和使用依據(jù)，缺乏從分子生物學(xué)層面上對肺癌治療方藥干預(yù)靶點(diǎn)的討論。故本文擬基于近20 年中醫(yī)治療肺癌的臨床文獻(xiàn)，通過復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的方法篩選治療肺癌的中藥方劑中的核心藥物，并結(jié)合中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫提供模型進(jìn)行核心藥物干預(yù)靶點(diǎn)預(yù)測，最后利用TCGA 腫瘤高通量基因組數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證關(guān)鍵干預(yù)靶點(diǎn)對肺癌患者生存期的影響。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

1.1.1 文獻(xiàn)來源 文獻(xiàn)檢索采用計(jì)算機(jī)檢索，限定語種為中文，檢索數(shù)據(jù)庫包括主要中文期刊文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫，包括中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)（WANFANG DATE）、維普中文期刊服務(wù)平臺(tái)（VIP）等。檢索策略使用主題詞檢索，其中疾病主題詞包括“肺癌”“肺腫瘤”“小細(xì)胞肺癌”“非小細(xì)胞肺癌”“鱗癌”“肺腺癌”“肺大細(xì)胞癌”，治療主題詞限定為“中藥”“中藥方劑”，兩部分主題詞之間以“And”連接。檢索年限均限定為1997-2017 年近20 年相關(guān)文獻(xiàn)。

1.1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn) ①研究對象選擇國內(nèi)所有中藥治療肺癌的臨床研究全文文獻(xiàn)；②診斷標(biāo)準(zhǔn)為《2015 年肺癌診療指南》明確診斷為“肺癌”的患者；③采用中藥治療為主，可合并其他常規(guī)腫瘤治療療法；④方劑配伍屬于《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》范疇，且效果確切；⑤明確給出方劑處方，中藥選擇包括草本、金石、羽翎、走獸等綱目。

1.1.3 文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn) ①根據(jù)“孤證不立”的原則，排除樣本數(shù)＜10 的專家經(jīng)驗(yàn)或個(gè)案報(bào)導(dǎo)文獻(xiàn)；②綜述、Meta 分析及機(jī)制研究等類型論文；③診斷不明確，或臨床癥狀表現(xiàn)與“肺癌”診斷標(biāo)準(zhǔn)不符；④重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)，僅納入一次；⑤會(huì)議論文或?qū)＜彝ㄐ拧?/p>

1.1.4 數(shù)據(jù)規(guī)范處理與挖掘 中藥名稱規(guī)范處理：本研究中，藥物名稱存在曾用名、通俗名、口語名等情況者均以《中華藥典》[6]為標(biāo)準(zhǔn)修訂規(guī)范。

中藥處方規(guī)范處理：雙人執(zhí)行納排標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行處方提取，對于符合標(biāo)準(zhǔn)的潛在相關(guān)文獻(xiàn)獲取其全文，所有有爭議的文獻(xiàn)經(jīng)雙人討論或請教第三人。

1.1.5 數(shù)據(jù)挖掘方法 數(shù)據(jù)庫建立：采用Microsoft Excel 建立“中藥方劑治療肺癌數(shù)據(jù)庫”，建立數(shù)據(jù)庫基本條目，包括：題目、第一作者、方劑名稱、中藥名稱、性味、歸經(jīng)等內(nèi)容。

關(guān)聯(lián)分析：使用專業(yè)數(shù)據(jù)挖掘軟件“IBM SPSS MODELER 18.0”版本進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，作為經(jīng)典的關(guān)聯(lián)規(guī)則算法之一，Apriori 算法中包含兩則重要定義即支持度（Support）與置信度（confidence）。支持度與置信度分別反映此關(guān)聯(lián)規(guī)則的有效性和確定性，就中藥A 與中藥B 的關(guān)聯(lián)規(guī)則而言：支持度即為同時(shí)出現(xiàn)中藥A 和中藥B 的概率，用以描述中藥間關(guān)聯(lián)規(guī)則的頻度，是對關(guān)聯(lián)規(guī)則重要性的度量。置信度是使用中藥A 的基礎(chǔ)上再使用中藥B 的概率，用以描述中藥間關(guān)聯(lián)規(guī)則的強(qiáng)度，是對關(guān)聯(lián)規(guī)則準(zhǔn)確性、可靠性的度量[7]。在本研究中均選取置信度≥10 的中藥配伍作為可信配伍。

1.1.6 復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用Gephi 軟件進(jìn)行復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，該軟件使用主要包括3 個(gè)步驟，即點(diǎn)與邊的輸入、拓?fù)錁?gòu)圖、網(wǎng)絡(luò)分析。

①點(diǎn)與邊的輸入：在本研究中，復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的點(diǎn)即中藥名稱，邊即通過Apriori 算法計(jì)算所得中藥—中藥支持度；

②拓?fù)錁?gòu)圖：拓?fù)錁?gòu)圖為可視化工作最重要的內(nèi)容之一，本研究中選擇的構(gòu)圖模式為Fruchterman Reingold 模式，即“重力離心”構(gòu)圖模式，將連接密度大的節(jié)點(diǎn)置于圖形中央，節(jié)點(diǎn)的位置隨重要程度逐漸由內(nèi)向外離散；

③網(wǎng)絡(luò)分析：通過復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析法篩選出其中重要的節(jié)點(diǎn)，故選擇度（Degree）與中介性（Betweenness centrality）兩指標(biāo)作為衡量節(jié)點(diǎn)重要程度的量化參考，其中度為某個(gè)節(jié)點(diǎn)連接的邊的總數(shù)目，該參數(shù)的意義在于衡量某個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)直接聯(lián)系的能力，度高的節(jié)點(diǎn)稱為度中心，代表其位于整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的直觀核心位置，中介性反映了節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中所處位置的樞紐程度，將具備高中介中心性的節(jié)點(diǎn)稱為中介中心，通過中介節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的樞紐特性，可提高節(jié)點(diǎn)之間的連接效率，提升網(wǎng)絡(luò)的連接特性。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制及關(guān)鍵干預(yù)靶點(diǎn)預(yù)測 核心藥物的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)效應(yīng)以及關(guān)鍵干預(yù)靶點(diǎn)預(yù)測模型來源于中藥方劑網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（BATMAN：http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），該數(shù)據(jù)庫是第一個(gè)專門為研究中藥分子機(jī)制而設(shè)計(jì)的在線生物信息學(xué)分析工具，該數(shù)據(jù)庫可預(yù)測每一種中藥成分的潛在靶點(diǎn)，然后對這些目標(biāo)進(jìn)行功能分析，包括基因本體（GO）、KEGG 途徑和omim/ttd 疾病濃縮分析。這些功能旨在促進(jìn)對中醫(yī)“多成分、多目標(biāo)、多途徑”組合治療機(jī)制的理解，為今后的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供線索。此外，數(shù)據(jù)庫還支持用戶同時(shí)輸入多味中藥（如成方或自擬方），通常用于同時(shí)分析一個(gè)方劑可能的多個(gè)作用靶點(diǎn)，幫助理解分子和系統(tǒng)層次的藥物組合原理[8]。

1.3 TCGA 腫瘤全基因組數(shù)據(jù)庫 腫瘤基因組圖譜（TCGA）計(jì)劃由美國National Cancer Institute（NCI）和 National Human Genome Research Institute（NHGRI）于2006 年聯(lián)合啟動(dòng)的項(xiàng)目，目前共計(jì)研究36 種癌癥類型。其數(shù)據(jù)來源于癌癥病人自愿捐贈(zèng)腫瘤組織及正常組織樣本，由人類癌癥生物標(biāo)本核心資源庫承擔(dān)癌癥組織標(biāo)本和正常組織標(biāo)本的采集、處理和分配工作，通過高通量測序中心（GSC）分析與各癌癥或者亞型相關(guān)的基因突變、擴(kuò)增或者缺失，包括mRNA 數(shù)據(jù)、microRNA 數(shù)據(jù)、Mutation 表現(xiàn)突變數(shù)據(jù)以及由蛋白芯片測序所得約200 種常見癌癥相關(guān)蛋白表達(dá)等數(shù)據(jù)[9]。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果 檢索流程如圖1 所示，根據(jù)文獻(xiàn)檢索策略及納排標(biāo)準(zhǔn)，最終納入符合標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)共計(jì)244篇，經(jīng)過人工閱讀提取，共提取肺癌相關(guān)中藥方劑306 則。

圖1 檢索流程

2.2 肺癌治療中藥方劑網(wǎng)絡(luò) 通過復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建肺癌治療中藥方劑網(wǎng)絡(luò)（見圖2），從圖中可以看出，黃芪、麥冬、北沙參、白術(shù)等藥物為治療肺癌中藥方劑中較重要的藥物。其中，黃芪位于整個(gè)模型的核心位置，不僅使用概率最高，也是和其他藥物配伍使用最多的藥物。通過量化網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中心程度的Degree 值和betweenness centrality 值我們也發(fā)現(xiàn)，黃芪數(shù)值遠(yuǎn)高于其他藥物，這表明在肺癌的中藥方劑配伍中不僅可以作為君藥統(tǒng)領(lǐng)諸藥，還可作為臣藥配合其他藥物更好發(fā)揮作用。

2.3 黃芪的干預(yù)靶點(diǎn)預(yù)測 通過中藥方劑網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測模型分析，利用主成分分析法，結(jié)合黃芪的化學(xué)成分，我們發(fā)現(xiàn)黃芪的提取物能有效干預(yù)PLD1 靶點(diǎn)。如圖3 所示，經(jīng)過GO 分析和KEGG 注釋，發(fā)現(xiàn)PLD1 作為許多細(xì)胞分化途徑的重要步驟，對包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜運(yùn)輸和有絲分裂都起干預(yù)作用，并可作為囊泡內(nèi)的膜運(yùn)輸核。其主要作用機(jī)制是通過刺激磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸，磷酸激酶活化的C-α，通過將ADP-核糖基化因子arf-1（-1）、以及由GTP-結(jié)合蛋白的Rho、Cdc42和Rac-1。

圖2 肺癌治療中藥方劑復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型及參數(shù)

圖3 黃芪潛在干預(yù)靶點(diǎn)PLD1 蛋白互作用機(jī)制

2.4 PLD1 在肺癌中的干預(yù)作用 通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫我們發(fā)現(xiàn)，在25 種腫瘤及亞型的橫向?qū)Ρ戎?，PLD1 在2 種肺癌亞型，包括831 例小細(xì)胞肺癌（LUAD）及874 例肺鱗癌（LUSC）中均呈現(xiàn)高表達(dá)（見圖4），尤其是在小細(xì)胞肺癌中，PLD1 在肺鱗癌組織中的表達(dá)是健康肺組織的2 倍以上。同時(shí)，根據(jù)來源于真實(shí)世界臨床病例的482 例小細(xì)胞肺癌以及477 例肺鱗癌的生存報(bào)告，繪制全生存周期內(nèi)的生存曲線，結(jié)果顯示，PLD1 高表達(dá)對于小細(xì)胞肺癌的生存周期具有重要影響且具備顯著性差異（HR=1.6，P=0.002），即PLD1 高表達(dá)人群在同一個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)內(nèi)死亡幾率是低表達(dá)人群的1.6 倍，但在肺鱗癌中我們并未觀察到PLD1 的表達(dá)量與生存周期存在明顯相關(guān)性。研究結(jié)果提示，降低PLD1 的表達(dá)對于提高肺癌尤其是小細(xì)胞肺癌患者的生存率具有重要意義，但對于肺鱗癌患者可能并無顯著作用。

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為“邪之所湊，其氣必虛”，辨證肺癌，多屬氣虛。黃芪性甘溫，歸肺脾經(jīng)，有補(bǔ)氣壯陽、固表斂汗之效，為傳統(tǒng)補(bǔ)氣之要藥。近年來，有關(guān)黃芪在防治腫瘤領(lǐng)域中的研究更是得到了科研人員的熱點(diǎn)關(guān)注。研究表明，黃芪化學(xué)成分相對復(fù)雜，主要包括有多糖、皂苷、黃酮等[10]。黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是其主要有效活性成分，在體外對Lewis 肺癌細(xì)胞有抑制轉(zhuǎn)移作用[11]。黃芪多糖不僅能誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可抑制Th1 型細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，起到調(diào)節(jié)T 細(xì)胞亞群的作用[12]。黃芪甲苷（astragaloside A）作為中藥黃芪的最主要單體活性成分之一，能抑制SPC-A-1 細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡率[13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，黃芪口服液、黃芪注射液，可改善老年肺癌患者的免疫功能，提高生存質(zhì)量，利于生存期的改善[14-15]。以黃芪為君藥的方劑如黃芪生脈飲、大黃芪湯對非小細(xì)胞型肺癌的治療有良好的輔助作用[16-17]。

圖4 PLD1 在肺癌中的表達(dá)情況及對生存率的影響

磷脂酶D（phospholipaseD，PLD）是調(diào)控機(jī)體磷脂代謝的重要酶類[18]，近年研究表明，在多種惡性腫瘤中，PLD 表達(dá)和活性增高，并可促進(jìn)腫瘤的增生和浸潤，PLD 對腫瘤細(xì)胞的生存、生長以及侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用主要是通過其酶解產(chǎn)物PA 與信號通路游靶分子的相互作用實(shí)現(xiàn)[19]。哺乳類動(dòng)物常見PLD1 和PLD2 2 種亞型[20]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，在多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)PLD1 活性異常升高，如胃癌、肝細(xì)胞癌等[21-22]。

肺癌是比較常見的惡性腫瘤之一，我國肺癌發(fā)病率處于不斷的攀升趨勢并趨于年輕化[23]，肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其治療的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。有關(guān)PLD1 與肺癌尤其是小細(xì)胞肺癌的生存周期關(guān)系的相關(guān)報(bào)道并不多見。通過中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫以及TCGA 腫瘤全基因組數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)挖掘方法探索預(yù)測中藥黃芪能有效的干預(yù)PLD1 這個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，并通過大數(shù)據(jù)高通量全基因組信息觀察調(diào)節(jié)PLD1 靶點(diǎn)對肺癌患者生存期的影響，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了一定的理論依據(jù)。