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    微小RNA-543對大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的作用機制研究

    2019-10-23 14:02羅奮棋林院徐杰
    中外醫(yī)學(xué)研究 2019年24期
    關(guān)鍵詞:骨關(guān)節(jié)炎軟骨誘導(dǎo)

    羅奮棋 林院 徐杰

    【摘要】 目的:研究微小RNA-543對大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞存在的保護作用機制。方法:此次研究選取20只健康SD(Sprague-Dawley)大鼠進行研究,采取隨機數(shù)字表法將入組的大鼠分成研究組和對照組,每組10只,對照組大鼠不進行特殊處理,研究組大鼠接受關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶切斷術(shù),構(gòu)建建立大鼠骨關(guān)節(jié)炎(OA)模型,采用PCR檢測方法分別檢測兩組大鼠軟骨組織的microRNA-543表達水平。對大鼠正常膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進行體外分離,10 ng/L的IL-1β培養(yǎng)24 h形成體外OA模擬狀態(tài),使用miR-543 mimics進行轉(zhuǎn)染,觀察分析miR-543過表達對IL-1β誘導(dǎo)條件下軟骨細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因表達水平的影響。結(jié)果:研究組大鼠的軟骨組織中miR-543的表達水平顯著低于對照組(P<0.05)。miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞的增殖率明顯高于對照組(P<0.05),經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著低于對照組(P<0.05),經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著上升(P<0.05)。miR-543 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDM4 mRNA表達水平明顯低于對照組(P<0.05),Akt1和Bcl-2 mRNA的表達顯著高于對照組(P<0.05),經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理后的軟骨細(xì)胞MDM4 mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05),Akt1和Bcl-2 mRNA表達則顯著低于對照組(P<0.05),經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后,IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表達水平的變化能夠得到顯著緩解(P<0.05)。結(jié)論:OA大鼠的軟骨組織miR-543表達會顯著下降,通過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染促進miR-543表達上調(diào),能夠使軟骨細(xì)胞的增殖得到提升,加之對MDM4、Akt1、Bcl-2表達的影響,能夠有效對抗IL-1β誘導(dǎo)引發(fā)的軟骨細(xì)胞損傷。

    【關(guān)鍵詞】 微小RNA-543; 骨關(guān)節(jié)炎; 軟骨細(xì)胞; 作用機制; 細(xì)胞凋亡

    doi:10.14033/j.cnki.cfmr.2019.24.001 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805(2019)24-000-03

    【Abstract】 Objective:To study the protective mechanism of microRNA-543 on the presence of chondrocytes in rat osteoarthritis.Method:In this study,20 healthy SD(Sprague-Dawley) rats were randomly divided into study group(n=10) and control group(n=10).The rats in the study group were treated without special treatment.The rats in the study group underwent medial collateral ligament cutting,and the model of osteoarthritis(OA) was established.The expression of microRNA-543 in cartilage tissue of the two groups was detected by PCR.Rat normal knee cartilage cells were isolated in vitro and cultured with 10 ng/L IL-1β for 24 h to form OA simulation in vitro.The effect of miR-543 overexpression on the proliferation of chondrocytes and the expression level of apoptosis-related genes under the induction of IL-1 under the induction of IL-1 was observed.Result:The expression level of miR-543 in cartilage tissue of the study group was significantly lower than that of the control group(P<0.05).The proliferation rate of cartilage cells induced by miR-543 mimics was significantly higher than that of the control group(P<0.05).The proliferation ability of cartilage cells induced by IL-1β was significantly lower than that of the control group(P<0.05).The proliferation ability of treated cartilage cells induced by IL-1β was significantly increased after miR-543 mimics transfection(P<0.05).The expression of MDM4 mRNA in miR-543 mimics transfected cells was significantly lower than that in the control group(P<0.05).The expression of Akt1 and Bcl-2 mRNA was significantly higher than that of the control group(P<0.05).The expression of MDM4 mRNA in chondrocytes induced by IL-1β was significantly higher than that in the control group(P<0.05),and the expression of Akt1 and Bcl-2 mRNA.The expression of MDM4,Akt1 and Bcl-2 mRNA in chondrocytes induced by IL-1β was significantly relieved after transfection with miR-543 mimics(P<0.05).Conclusion:The expression of miR-543 in cartilage tissue of OA rats is significantly decreased.The expression of miR-543 is up-regulated by miR-543 mimics transfection,which can enhance the proliferation of chondrocytes and the expression of MDM4,Aktl and Bcl-2.The effect is effective against the chondrocyte damage induced by IL-1β.

    【Key words】 MicroRNA-543; Osteoarthritis; Chondrocytes; Mechanism of action; Apoptosis

    First-authors address:Fujian Medical University Provincial Clinical College,F(xiàn)uzhou 350001,China

    骨關(guān)節(jié)炎屬于關(guān)節(jié)邊緣處的退行性病變,其發(fā)生和發(fā)展與年齡、體重、外部創(chuàng)傷、勞損及先天性異常等因素,具有密切關(guān)系,是多樣因素引發(fā)的關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣及軟骨下骨反應(yīng)性增生[1-2]。骨關(guān)節(jié)炎在老年患者中具有較高的發(fā)病率,屬于常見的慢性疾病,患者會出現(xiàn)緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、壓痛及僵硬、腫脹和活動受限等癥狀,對患者的生活質(zhì)量會產(chǎn)生嚴(yán)重影響[3-4]。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制較為復(fù)雜,研究分析認(rèn)為軟骨細(xì)胞的異常遷移和增殖,引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)功能異常,可能是導(dǎo)致疾病發(fā)生的主要原因,也是臨床治療中最主要的靶標(biāo)[5-6]。微小RNA作為內(nèi)源性非編碼小RNA,能夠翻譯抑制或切割靶基因RNA,進而使蛋白質(zhì)的表達水平下降,對細(xì)胞增殖與凋亡形成調(diào)控作用[7-8]。既往研究中對miR-543在骨肉瘤腫瘤細(xì)胞等方面的作用進行了分析,但對于其在骨關(guān)節(jié)炎中的作用機制尚未進行研究,相關(guān)作用機制尚不明確[9-11]。此次研究選取20只健康SD(Sprague-Dawley)大鼠進行研究,對比分析正常大鼠和關(guān)節(jié)炎大鼠的microRNA-543表達水平,并通過體外分離和IL-1β誘導(dǎo),分析miR-543過表達對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因及炎癥因子表達的影響,進一步研究和明確微小RNA-543對大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的保護作用機制,報告如下。

    1 材料與方法

    1.1 一般材料

    此次研究選取20只健康SD(Sprague-Dawley)大鼠(濟南金豐實驗動物有限公司)進行研究,入組后大鼠均使用常規(guī)飼料喂養(yǎng),體重范圍是320~350 g,平均體重(328.46±5.26)g,采取隨機數(shù)字表法將入組的大鼠分成研究組和對照組,每組10只,對照組大鼠不進行特殊處理,研究組大鼠接受關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶切斷術(shù),建立大鼠骨關(guān)節(jié)炎(OA)模型,使用0.5%的水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉,使用劑量為0.35 g/100 g。在完成手術(shù),兩組大鼠均連續(xù)3 d肌肉注射青霉素,使用劑量是2×104 U/kg。在1周后,驅(qū)趕兩組大鼠進行跑步運動,30 mim/d。入組大鼠的選取和應(yīng)用均符合美國國家衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南要求。

    1.2 實驗方法

    軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)和miR-543 mimics轉(zhuǎn)染方法:在無菌環(huán)境下,摘取正常大鼠的雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨,切下一部分組織進行RNA提取,剩余部分放到含雙抗的磷酸鹽緩沖液中進行清洗,300 g離心處理10 min后,去除上清,使用20%FBS DEME-F12培養(yǎng)液進行培養(yǎng),溫度37 ℃,濕度適度,空氣環(huán)境5%CO2。在實施轉(zhuǎn)染的前1 d,以2×105/cm2的密度,把待轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到12孔板上,當(dāng)細(xì)胞融合率達到60%~80%時,按照轉(zhuǎn)染試劑盒的說明要求實施miR-543 mimics轉(zhuǎn)染,并進行相應(yīng)的陰性對照,在驗證轉(zhuǎn)染效率之后實施后續(xù)實驗步驟。

    軟骨細(xì)胞增殖能力檢測方法:制取對數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞,于96孔板中進行接種,每孔的接種細(xì)胞數(shù)量是5 000個,每組設(shè)置6個復(fù)孔,并設(shè)立無細(xì)胞空白對照組。在軟骨細(xì)胞miR-543 mimics轉(zhuǎn)染之后,10 ng/L的IL-1β培養(yǎng)24 h,每孔當(dāng)中加入5 μg/ml的MTT溶液20 μl,在孵育4 h后,去除上清,每孔加200 μl的DMSO,振蕩處理10 min之后,使用酶標(biāo)儀讀取光密度值,重復(fù)三次讀取。

    細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和炎癥因子的檢測方法:使用PCR方法檢測,在6孔板中培養(yǎng)原代軟骨細(xì)胞,miR-543 mimics不轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染48 h條件下,10 ng/L的IL-1β培養(yǎng)24 h,使用TRIzo1試劑盒提取細(xì)胞總RNA,再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA之后實施PCR檢測,觀察基因表達水平,按照說明書要求操作。反應(yīng)的條件是90 ℃環(huán)境下3 min。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,計量資料以(x±s)表示,采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同組別軟骨組織及細(xì)胞中的miR-543表達水平對比

    研究發(fā)現(xiàn),對照組大鼠和對照細(xì)胞的miR-543相對表達水平是1.00,研究組的表達水平是(0.62±0.16),經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理組的水平是(0.74±0.17),研究組大鼠的軟骨組織中miR-543的表達水平顯著低于對照組(P=0.012),經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞miR-543的表達水平顯著低于未進行誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞(P=0.024),見圖1。

    2.2 miR-543表達水平上調(diào)對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖能力的影響

    研究發(fā)現(xiàn),對照組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞相對存活情況是(1.00±0.18),經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理組是(0.51±0.14),miR-543 mimics轉(zhuǎn)染組是(1.29±0.12),經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞相對存活情況是(0.89±0.19),miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞的增殖率明顯高于對照組(P=0.024),經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著低于對照組(P=0.027),經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著上升(P=0.035),miR-543 mimics轉(zhuǎn)染能夠逆轉(zhuǎn)IL-1β對細(xì)胞增殖作用的抑制效果,見圖2。

    2.3 miR-543表達水平上調(diào)對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達的影響分析

    研究發(fā)現(xiàn),對照組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平均是1.00,經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平分別是(1.47±0.29)、(0.64±0.18)和(0.49±0.12),miR-543 mimics轉(zhuǎn)染組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平分別是(0.46±0.17)、(1.42±0.24)和(1.51±0.18),經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后IL-1β誘導(dǎo)處理組的MDM4、Akt1和Bcl-2相對表達水平分別是(0.97±0.12)、(0.87±0.19)和(0.82±0.11)。miR-543 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDM4 mRNA表達水平明顯低于對照組(P=0.028),Akt1和Bcl-2 mRNA的表達顯著高于對照組(P=0.024,0.260),經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理后的軟骨細(xì)胞MDM4 mRNA表達顯著高于對照組(P=0.030),Akt1和Bcl-2 mRNA表達則顯著低于對照組(P=0.028、0.027),經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后,IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表達水平的變化能夠得到顯著緩解(P=0.022、0.024、0.027),見圖3。

    3 討論

    此次研究中,通過大鼠OA模型的構(gòu)建進行研究,研究結(jié)果表明,研究組大鼠的軟骨組織中miR-543的表達水平顯著低于對照組(P<0.05),經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞miR-543的表達水平顯著低于未進行誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞(P<0.05);miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞的增殖率明顯高于對照組,經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著低于對照組(P<0.05),經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞增殖能力顯著上升(P<0.05),miR-543 mimics轉(zhuǎn)染能夠逆轉(zhuǎn)IL-1β對細(xì)胞增殖作用的抑制效果;miR-543 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞MDM4 mRNA表達水平明顯低于對照組,Akt1和Bcl-2 mRNA的表達顯著高于對照組(P<0.05),經(jīng)過IL-1β誘導(dǎo)處理后的軟骨細(xì)胞MDM4 mRNA表達顯著高于對照組,Akt1和Bcl-2 mRNA表達則顯著低于對照組(P<0.05),經(jīng)過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染后,IL-1β誘導(dǎo)處理過的軟骨細(xì)胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表達水平的變化能夠得到顯著緩解(P<0.05)。研究結(jié)果表明,miR-543表達可能屬于骨關(guān)節(jié)炎分子生物學(xué)的病因,通過miR-543表達水平的監(jiān)測,能夠為骨關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生發(fā)展情況提供依據(jù),同時外源性的miR-543補充能夠在骨關(guān)節(jié)炎病情控制中發(fā)揮積極作用。

    骨關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)展過程中,軟骨細(xì)胞異常凋亡屬于主要作用機制之一,MDM4能夠定位在凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞器線粒體上,將TP53線粒體的凋亡途徑激活,同時還能夠抑制抗凋亡蛋白Bcl-2,增加細(xì)胞色素C釋放,進而產(chǎn)生促進細(xì)胞凋亡的效果;至于Akt1能夠?qū)TOR信號通路進行調(diào)控,從而減緩細(xì)胞凋亡。miR-543表達水平上調(diào)后,MDM4表達下降,而Akt1、Bcl-2表達上升,在IL-1β誘導(dǎo)作用后,miR-543表達能夠使MDM4釋放受到抑制,提升Akt1、Bcl-2表達水平[12-13]。在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病當(dāng)中,炎癥因子的過表達和病情嚴(yán)重程度具有密切關(guān)系,大量釋放炎癥因子既會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞損傷,還會使軟骨細(xì)胞分化及誘導(dǎo)ECM降解的作用受到影響[14-15]。

    綜上所述,OA大鼠的軟骨組織miR-543表達會顯著下降,通過miR-543 mimics轉(zhuǎn)染促進miR-543表達上調(diào),能夠使軟骨細(xì)胞的增殖得到提升,加之對MDM4、Akt1、Bcl-2表達的影響,能夠有效對抗IL-1β誘導(dǎo)引發(fā)的軟骨細(xì)胞損傷。

    參考文獻

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    (收稿日期:2019-07-10) (本文編輯:張亮亮)

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