下丘腦-垂體-腎上腺軸紊亂對小鼠變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中免疫機(jī)制的影響

劉靜, 楊敬, 雍惠, 侯麗, 高小平

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(寧夏銀川 750004)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是耳鼻喉科常見的上呼吸道慢性炎癥，臨床上以發(fā)作性噴嚏、鼻癢、流清涕和鼻塞等為主要癥狀[1]。AR發(fā)病率較高，全球范圍內(nèi)AR發(fā)病率為10%～25%，且有逐年增高的趨勢，已經(jīng)成為人類的公共健康問題[2]。研究表明[3]，AR是鼻黏膜在由免疫球蛋白 E(immunoglobulin E,IgE)介導(dǎo)，多種炎癥介質(zhì)參與下發(fā)生的變態(tài)反應(yīng)性炎癥，與機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)。AR的發(fā)作與季節(jié)或晝夜的交替變化而出現(xiàn)規(guī)律的緩解或加重。報道稱[4]，下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA)對這種呈節(jié)律變化的應(yīng)變性疾病具有調(diào)控作用，具體機(jī)制為HPA可通過節(jié)律性分泌糖皮質(zhì)激素調(diào)控視交叉上核生理活性，視交叉上核作為變應(yīng)性疾病調(diào)控中樞的起搏點，影響著疾病發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，此調(diào)控作用已在被動皮膚變態(tài)反應(yīng)中得到證實。而HPA與AR發(fā)病中免疫機(jī)制的關(guān)系目前尚無報道，2018年3月至2019年1月本研究通過構(gòu)建AR小鼠模型，探討HPA對AR發(fā)病中免疫機(jī)制的影響，以期為臨床治療AR提供新的靶點奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)購自瀚香生物科技有限公司；氫氧化鋁購自美國 Sigma 公司；卵清蛋白特異性IgE(ovalbumin-sIgE，OVA-sIgE)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adreno cortico tropic hormone，ACTH)和皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；蘇木素伊紅(hematoxylin red，HE)染色試劑盒購自德國羅氏公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、DAB化學(xué)發(fā)光試劑盒、Foxp3、RORγt抗體均購自上海仁捷生物科技有限公司；TRIzol提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司；Taq DNA 聚合酶購自北京博大泰克生物技術(shù)公司；IFN-γ、IL-4和β-actin引物購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司；凝膠成像儀購自美國Gene Genius公司。

1.2 動物分組 SPF 級昆明雄性小鼠80只，體重 21～24 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2014-0010]，動物合格證號: 00002006。將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為4組：空白對照組，AR模型組，單側(cè)腎上腺切除(adrenalectomy，ADX)/AR組，雙側(cè)ADX/AR組，每組20只。

1.3 動物模型

1.3.1 腎上腺切除小鼠模型 大鼠術(shù)前12 h禁食，使用 1% 戊巴比妥鈉(注射劑量為65 mg/kg) 將大鼠麻醉后，定位儀固定，剃光手術(shù)部位毛發(fā)后用碘伏擦拭消毒，縱向剪開脊柱外側(cè)皮膚做平行切口，長約1 cm，分離肌層，將位于腎臟上極的腎上腺暴露在視野內(nèi)，并完整切除，縫合切口。為了防止術(shù)后感染，手術(shù)后給予8 萬單位青霉素腹腔注射7 d，并觀察大鼠的生命體征。單側(cè)ADX則只進(jìn)行左側(cè)，雙側(cè)ADX則先進(jìn)行左側(cè)再進(jìn)行右側(cè)。術(shù)后恢復(fù)14 d行AR造模。

1.3.2 AR小鼠模型 AR模型參照文獻(xiàn)[5]方法，造模組小鼠分別在第1、7、14天腹腔注射OVA(50 μg)和氫氧化鋁(4 mg)進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，第21～32天自前鼻孔用6% OVA滴鼻局部刺激激發(fā)，每次50 μL/側(cè)，1次/d，連續(xù)12 d，空白對照組均用等量無菌磷酸鹽緩沖液代替致敏和激發(fā)。末次滴鼻局部刺激后 2 h 處死小鼠，收集血清，顯微鏡下剝離鼻中隔黏膜組織。

1.4 AR模型癥狀學(xué)評分 于末次滴鼻局部刺激后立即觀察小鼠搔鼻、噴嚏及流涕情況，時間30 min。根據(jù)表1中評分標(biāo)準(zhǔn)，采用量化疊加法評分。

表1 癥狀學(xué)評分

1.5 鼻黏膜組織病理學(xué)檢測 鼻中隔黏膜用4%的甲醛固定24 h后進(jìn)行常規(guī)脫水和石蠟包埋，將石蠟塊切成5 μm厚度的切片，進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察各組鼻黏膜中炎性細(xì)胞的浸潤情況。

1.6 血清OVA-sIgE、ACTH和CORT水平 取各組備用的小鼠血清，采用ELISA法檢測OVA-sIgE、ACTH和CORT指標(biāo)水平，相關(guān)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 qRT-PCR 法檢測鼻黏膜組織中γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL)-4的mRNA表達(dá) TRIzol試劑提取總RNA，按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR方法進(jìn)行實時定量PCR，并以U6為內(nèi)參。反應(yīng)條件為94℃，30 s，1個循環(huán)；95℃，5 s，60℃，30 s，40個循環(huán)；95℃，5 s，60℃，1 min，95℃，1個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物進(jìn)行 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳20 min，PUX Mix Marker 作為分子量參照物同時電泳，以大鼠 β-actin為內(nèi)參，引物序列見表2，凝膠成像分析儀在紫外光下采集圖像，采用 Gepro 4.2 軟件分析目的基因與同一條帶β-actin的光密度比值。

表2 引物序列和產(chǎn)物長度

1.8 Western blot法檢測鼻黏膜組織 Foxp3、RORγt 蛋白表達(dá) 取各組鼻黏膜組織加入RIPA組織裂解液，冰浴5 min后離心，離心條件：13 000 r/min，4℃，時間10 min，獲得上清液，BCA法測定蛋白含量。每個樣本取50 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS -PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加稀釋好的一抗，4℃過夜孵育。次日，取出恢復(fù)至室溫， PBST充分洗膜，加適量稀釋好的HRP標(biāo)記的二抗，室溫震蕩1 h，PBST洗膜，加ECL進(jìn)行顯色，拍照及灰度掃描，最后用Image J 軟件分析條帶的灰度值，并以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，計算蛋白的相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用獨立t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評分 空白對照組小鼠無明顯打噴嚏、搔鼻及清鼻涕癥狀。與空白對照組相比，AR模型組小鼠劇烈搔鼻，噴嚏及清鼻涕較多，癥狀評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ADX后，與AR模型組相比，單、雙側(cè)ADX/AR組癥狀均明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，雙側(cè)ADX/AR組效果更為明顯，與單側(cè)ADX/AR組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.2 鼻黏膜組織病理學(xué)檢測 空白對照組小鼠鼻黏膜基底層細(xì)胞排列整齊，嗜酸粒細(xì)胞未見炎性細(xì)胞浸潤；AR模型組小鼠鼻黏膜基底膜細(xì)胞排列紊亂，可見大量嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤；單側(cè)ADX/AR組小鼠鼻黏膜基底膜細(xì)胞排列不規(guī)則，大量嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤；雙側(cè)ADX/AR組小鼠鼻黏膜上皮纖毛有少量破壞，基底層細(xì)胞排列欠整齊，少量嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

項目n癥狀評分(分)空白對照組202.42±0.35AR模型組206.58±0.56?單側(cè)ADX/AR組205.86±0.51△雙側(cè)ADX/AR組205.12±0.48△▲F值10.286P值0.000

*與空白對照組比較P<0.05；△與AR模型組比較P<0.05；▲與單側(cè)ADX/AR組比較P<0.05

2.3 血清ATCH、CORT、OVA-sIgE水平比較 與空白對照組相比，AR模型組中ATCH、CORT水平無明顯變化(P>0.05)，OVA-sIgE水平明顯升高(P<0.05)；與AR模型組相比，單、雙側(cè)ADX/AR組血清ATCH、CORT、OVA-sIgE水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且雙側(cè)ADX/AR組更為明顯，與單側(cè)ADX/AR組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.4 鼻黏膜組織IL-4 mRNA、IFN-γ mRNA表達(dá) 與空白對照組相比，AR模型組鼻黏膜組織中IL-4 mRNA表達(dá)率明顯升高，IFN-γ mRNA明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與AR模型組相比，單、雙側(cè)ADX/AR小鼠IL-4 mRNA表達(dá)率明顯降低，IFN-γ mRNA明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且雙側(cè)ADX/AR組結(jié)果更顯著，與單側(cè)ADX/AR組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表5。

2.5 鼻黏膜組織Foxp3、RORγt 蛋白表達(dá)比較 與空白對照組相比，AR模型組鼻黏膜組織中Foxp3蛋白表達(dá)率明顯降低，RORγt 表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與AR模型組相比，單、雙側(cè)ADX/AR小鼠Foxp3蛋白表達(dá)率明顯降低，RORγt 表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且雙側(cè)ADX/AR組變化更顯著，與單側(cè)ADX/AR組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、表6。

A:空白對照組；B:AR模型組；C:單側(cè)ADX/AR組；D:雙側(cè)ADX/AR組

圖1各組小鼠鼻黏膜組織HE染色(HE×400)

3 結(jié)果

AR是一種難以治愈但可長期控制的過敏性疾病，近年來，AR的發(fā)病率持續(xù)升高[6]。關(guān)于AR的病理機(jī)制研究主要聚焦于免疫方面，但生活節(jié)奏的變化通過影響機(jī)體神經(jīng)及神經(jīng)內(nèi)分泌對這種變應(yīng)性疾病的調(diào)節(jié)也起到重要作用[7]。本研究在AR模型基礎(chǔ)上通過ADX途徑，探討HPA軸對AR免疫系統(tǒng)的影響機(jī)制。

過敏性免疫應(yīng)答會導(dǎo)致血清或組織中OVA-sIgE表達(dá)、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的變化[8]。本研究中，基礎(chǔ)致敏及激發(fā)后，AR模型組小鼠的癥狀評分、血漿OVA-sIgE表達(dá)顯著高于空白對照組，鼻黏膜組織的病理圖片明顯變化，證實AR造模成功。與模型組相比，雙側(cè)ADX/AR組小鼠的上述指標(biāo)均明顯降低，而單側(cè)ADX/AR組與雙側(cè)ADX/AR組存在相同的變化趨勢，但兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示ADX后小鼠CORT水平下降，減弱了內(nèi)分泌系統(tǒng)的整體反應(yīng)水平，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)反應(yīng)降低。單側(cè)ADX后，機(jī)體存在相應(yīng)的代償機(jī)制，如ADX后其他激素、神經(jīng)肽等分泌異常升高，但與模型組相比仍存在明顯差異[9]。

已有研究表明[10]，AR是機(jī)體Th1/Th2 免疫失衡后引起鼻黏膜Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞的優(yōu)勢分化的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)，此過程中Th1和Th2細(xì)胞分泌不同的細(xì)胞因子。本研究通過檢測血清中IFN-γ和IL-4水平，分別用于反映Th1型細(xì)胞和Th2型細(xì)胞狀態(tài)。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，AR模型組小鼠的IL-4表達(dá)率明顯升高，IFN-γ明顯降低，結(jié)果與以往研究相符。與AR模型組相比，ADX/AR小鼠IL-4表達(dá)率明顯降低，IFN-γ明顯升高，且雙側(cè)ADX/AR組結(jié)果更顯著，提示ADX小鼠AR癥狀的抑制可能與IFN-γ表達(dá)升高和IL-4表達(dá)降低有關(guān)。有研究表明[11]，HPA介導(dǎo)的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素分泌有助于T細(xì)胞增殖，促進(jìn)變態(tài)反應(yīng)向Th2進(jìn)展，這可能與糖皮質(zhì)激素的大量表達(dá)會增強(qiáng)T細(xì)胞表面受體信號活性有關(guān)。由此推測雙側(cè)ADX后造成HPA紊亂，導(dǎo)致T細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合能力減弱，進(jìn)而Th2反應(yīng)降低，AR癥狀減輕。

項目nACTH(pg/mL)OVA-sIgE(ng/mL)CORT(ng/mL)空白對照組2090.25±8.622.48±0.52495.30±15.26AR模型組2093.52±8.656.85±0.86?510.54±17.65單側(cè)ADX/AR組2060.26±7.62△5.53±0.52△280.65±10.62△雙側(cè)ADX/AR組2045.62±6.25△▲4.15±0.36△▲142.28±10.62△▲F值65.85442.98710.902P值0.0000.0000.000

*與空白對照組比較P<0.05；△與AR模型組比較P<0.05；▲與單側(cè)ADX/AR組比較P<0.05

圖2qRT-PCR檢測各組鼻黏膜組織IL-4mRNA、IFN-γmRNA表達(dá)

表5各組鼻黏膜組織IL-4mRNA、IFN-γmRNA表達(dá)

項目nIL-4 mRNAINF-γ mRNA空白對照組201.09±0.080.99±0.12AR模型組203.09±0.21?0.36±0.07?單側(cè)ADX/AR組202.12±0.16△0.62±0.08△雙側(cè)ADX/AR組201.67±0.11△▲0.75±0.05△▲F值6.0929.029P值0.0090.000

*與空白對照組比較P<0.05；△與AR模型組比較P<0.05；▲與單側(cè)ADX/AR組比較P<0.05

圖3 Western blot法檢測各組鼻黏膜組織Foxp3、RORγt 蛋白表達(dá)

項目nFoxp3RORγt空白對照組201.05±0.05 1.00±0.04AR模型組200.23±0.03?1.87±0.12?單側(cè)ADX/AR組200.43±0.03△1.57±0.08△雙側(cè)ADX/AR組200.75±0.05△▲1.25±0.05△▲F值15.63212.783P值0.0000.000

*與空白對照組比較P<0.05；△與AR模型組比較P<0.05；▲與單側(cè)ADX/AR組比較P<0.05

Treg和Th17細(xì)胞屬于CD4+T 細(xì)胞亞群，兩者在生理功能上相互制約，共同參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[12]。Treg通過轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞、單核巨嗜細(xì)胞的活性，發(fā)揮免疫抑制作用。RORγt作為Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可通過募集中性粒細(xì)胞促進(jìn)多種免疫細(xì)胞的分化及成熟[13]。當(dāng)機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)時，F(xiàn)oxp3表達(dá)增強(qiáng)，T細(xì)胞趨于向Treg細(xì)胞方向分化，維持免疫耐受。當(dāng)發(fā)生炎癥反應(yīng)或感染時，免疫系統(tǒng)激活，RORγt產(chǎn)生，誘導(dǎo) T 細(xì)胞向 Th17 細(xì)胞分化，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[14]。研究表明[15]，Treg/Th17失調(diào)也與變應(yīng)性疾病密切相關(guān)。Li等[16]發(fā)現(xiàn)，變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠可通過調(diào)節(jié)Treg/Th17免疫平衡發(fā)揮治療作用。Wang等[17]研究結(jié)果顯示，Treg/Th17 失調(diào)是導(dǎo)致氣道變應(yīng)性疾病如哮喘持續(xù)發(fā)作的重要機(jī)制。Zhou等[18]對120例過敏性鼻炎患者外周血Treg/Th17免疫反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比Treg 細(xì)胞比例明顯減少，Th17細(xì)胞比例明顯升高，說明Treg/Th17免疫失衡參與過敏性鼻炎的發(fā)病過程。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，AR模型組小鼠Foxp3 表達(dá)明顯下降，RORγt表達(dá)明顯升高，提示AR的發(fā)生與Treg/Th17 失調(diào)有關(guān)。相比AR模型組，雙側(cè)ADX/AR組Foxp3 表達(dá)明顯升高，RORγt表達(dá)明顯降低。研究發(fā)現(xiàn)[19]，低水平CORT可促進(jìn)Foxp3表達(dá)，促進(jìn)Treg細(xì)胞的發(fā)育和增殖。提示ADX小鼠癥狀減輕可能與HPA紊亂對Treg/Th17免疫的調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述，ADX/AR小鼠HPA功能紊亂抑制病情進(jìn)展，可能與HPA紊亂調(diào)節(jié)Th1/Th2和Treg/Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)平衡有關(guān)，但是否與其他途徑有關(guān)需要進(jìn)一步探討。