血清炎性因子及耳蝸組織神經(jīng)營養(yǎng)因子對老年性耳聾大鼠的影響

翟建光， 周姍姍

1河南科技大學第二附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科(河南洛陽 471000)； 2新安縣人民醫(yī)院五官科(河南洛陽 471800)

老年性耳聾指隨著年齡的增長，聽覺器官衰老，發(fā)生退變，導致雙耳發(fā)生神經(jīng)性聽力減退，主要的臨床特點是損失高頻聽力。目前老年性耳聾的分子機制是研究的重點。白細胞介素(interleukin，IL)可以作用于多種細胞，IL-1β、IL-6具有免疫調(diào)節(jié)作用，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)通過刺激人血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生凝血活性，影響聽力[1]。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)對正常神經(jīng)細胞起營養(yǎng)因子的作用，可以修復和保護損傷的神經(jīng)細胞, 神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3,NT-3)能夠支持聽覺神經(jīng)元的存活[2]。鈣蛋白酶(Calpain)被激活預(yù)示著細胞凋亡和發(fā)生變形壞死，與神經(jīng)退行性病變有緊密的聯(lián)系[3]。2017年5月至2018年2月，本研究通過對老年性耳聾大鼠血清炎性因子及耳蝸組織神經(jīng)營養(yǎng)因子的檢測，探究其對老年性耳聾大鼠的影響，具體情況如下。

1 材料與方法

1.1 動物 選取150只Wistar大鼠，由佳木斯大學動物研究中心提供，雌雄不限，年齡26～36個月，平均(30.2±2.1)個月，體重200～250 g，平均(223.5±8.1)g。所有大鼠均在干凈籠子里養(yǎng)殖，室內(nèi)溫度在(21.5±1.8)℃，相對濕度32%～38%，每天12 h光照，喂飲純凈水。本次研究所做實驗均獲得我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 在150只Wistar大鼠中隨機選取80只大鼠頸部皮下注射500 mg的5% D-半乳糖，1次/d，持續(xù)進行7個周后，采用ABR法檢測大鼠聽力反應(yīng)閥值，給予80只大鼠400 mg的10%水合氯醛腹腔注射，用TDT系統(tǒng)測定大鼠麻醉狀態(tài)下的聽力反應(yīng)閥值，把標準短聲作為刺激聲，將TDT系統(tǒng)的給聲頻率調(diào)至12.0 Hz，脈沖寬度調(diào)至0.1 ms，掃描時程10 ms，重復掃描520次，帶通濾波為200～2 500 Hz，監(jiān)測最穩(wěn)定的Ⅲ波出現(xiàn)，將Ⅲ波消失時的聲壓級作為聽力反應(yīng)閥值，以聽力反應(yīng)閥值30位分界線，聽力反應(yīng)閥值高于30的劃分為老年耳聾組。對剩余70只大鼠同樣采用ABR法檢測大鼠聽力反應(yīng)閥值，聽力反應(yīng)閥值低于30的劃分為老年正常組。其中老年耳聾組72只，老年正常組48只。

1.2.2 標本采集 將兩組大鼠使用3 mL/kg的氯胺酮進行腹腔注射麻醉，固定好后，使用手術(shù)刀開胸，并往心臟內(nèi)灌注4℃的生理鹽水，直至溢出液體澄清后停止。將大鼠耳蝸及前庭組織用手術(shù)刀切除后，保存至液氮中10 min后，用勻漿器以30 s低速勻漿3 min，冰浴1 min，過程重復至組織完全裂解，然后經(jīng)過冷凝處理后，用離心機以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速分離20 min，取上清液冷凍保存至-70℃的冰箱中。

1.2.3 ELISA法檢測血清炎性因子的表達 采用酶聯(lián)免疫吸附法，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，在ELISA試劑盒中加入待測樣本，使血清和固相抗原充分結(jié)合，洗滌去除雜質(zhì)后加入微孔板酶標儀中，經(jīng)過酶標抗體反應(yīng)形成復合物后再加入底物顯色，通過比色檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、血管細胞黏附因子1(vascular cell adhesion molecule-1,sVCAM-1)、血管內(nèi)皮細胞鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、高遷移率蛋白-1(mobility group protein box 1,HMGB1)的量，進行接下來的指標水平比較。

1.2.4 Western blot法檢測NGF、NT-3表達水平 將凍存標本通過細胞漿蛋白抽提試劑盒將其中總蛋白提取。使用SDS-PAGE凝膠來進行電泳，加入濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液，靜置20 min；在100 V的環(huán)境中電泳10 min后，把電轉(zhuǎn)膜放置搖床上，封閉在37℃環(huán)境中，然后添加10%的牛奶后靜置2 h；在一抗中加入TBST稀釋，按照1∶ 1 000的比例稀釋后加入待測樣本，經(jīng)過孵育后保存至4℃的環(huán)境內(nèi)；第2天用TBST緩沖液清洗，在常溫的環(huán)境中加入二抗，孵育1 h。再次用TBST緩沖液清洗，最后加入底物溶液進行顯色，采用BCA蛋白定量試劑盒，分析灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值，達到檢測NGF、NT-3表達水平的目的。

1.2.5 化學發(fā)光分析法檢測鈣蛋白酶表達 采用化學發(fā)光分析法，將化學發(fā)光物質(zhì)加入至待測標本，按順序依次與催化劑及氧化劑反應(yīng)，最終會形成處于激發(fā)狀態(tài)的中間體，當中間體穩(wěn)定的時候，其會發(fā)射出光子，嚴格按照化學發(fā)光分析儀操作步驟，利用發(fā)光信號測量儀測量光子數(shù)值，檢測鈣蛋白酶的水平。

1.2.6 RT-PCR法檢測鈣蛋白酶mRNA的表達 采用熒光定量RT-PCR法，嚴格按照定量PCR儀的使用說明書進行操作。首先加入2.5 μL的稀釋10倍的PCR緩沖液，1.5 μL MgCl2溶液以及0.5 μL上游引物和下游引物，最后通過加水，配置成總體積為25 μL的反應(yīng)體系。將其放置在94℃環(huán)境中1 min，55℃環(huán)境中1 min；72℃環(huán)境中1 min，為一個循環(huán)，重復進行40個循環(huán)，在72℃環(huán)境中反應(yīng)延長3 min，最少延長3次。采用2-ΔΔCt方法計算出要檢測鈣蛋白酶mRNA的表達水平。

1.2.7 大鼠耳蝸基底膜形態(tài)觀察 對兩組大鼠進行全麻處理，采用斷頭法處死，將大鼠兩側(cè)聽泡取出，并使用蒸餾水進行沖洗、待用。使用眼科剪將所取大鼠聽泡打開，使耳蝸暴露出來，用細針頭在蝸尖處做一小口，并使用2 mL 0.5%硝酸銀溶液灌注，在使用蒸餾水進行灌注沖洗2次。使用10%中性甲醛固定液自所做小孔處灌注耳蝸，灌注3次之后將其放置于固定液中，并于4℃冰箱內(nèi)4 h進行固定還原。使用10 W白熾燈在距離10 cm處進行照射，耳蝸組織變?yōu)樽睾稚礊槠毓馊旧晒Α⑵毓馊旧晒Φ亩佄佪S固定，在解剖顯微鏡下放大并將基底膜剝離，將剝離后的基底膜平整放置在載玻片上，蓋片封固，置于高倍顯微鏡下觀察、攝片。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差描述，兩組間比較采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠耳蝸基底膜形態(tài)學 老年正常組大鼠耳蝸細胞清晰可見、大小均勻且排列緊密，界限較為清晰，且基本無細胞缺失現(xiàn)象；老年耳聾組模型大鼠相比老年正常組大鼠，細胞不清晰且大小不一，排列較為雜亂，存在明顯的細胞缺失或脫落現(xiàn)象。見圖1。

A：老年正常組；B：老年耳聾組

2.2 兩組耳蝸TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平 老年耳聾組耳蝸TNF-α、IL-1β及IL-6表達水平明顯高于老年正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

項目nTNF-αIL-1βIL-6老年正常組4852.12±9.6425.62±7.584.63±0.82老年耳聾組72175.35±31.8679.37±18.4721.52±4.06t值26.7912.5131.58P值0.010.030.01

2.3 兩組耳蝸sVCAM-1、VE-cadherin、HMGB1表達水平 老年耳聾組耳蝸sVCAM-1、VE-cadherin及HMGB1表達水平明顯低于老年正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4 兩組耳蝸NGF、NT-3蛋白表達水平 老年耳聾組耳蝸NGF、NT-3蛋白含量明顯低于老年正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.5 兩組耳蝸鈣蛋白酶及鈣蛋白酶mRNA表達水平 老年耳聾組耳蝸鈣蛋白酶、鈣蛋白酶mRNA表達水平顯著高于老年正常組(P<0.05)。見表4。

項目nsVCAM-1(ng/mL)VE-cadherin(mg/L)HMGB1(mg/L)老年正常組48293.36±27.525.64±0.613.95±0.47老年耳聾組72201.83±21.072.82±0.331.92±0.21t值20.4531.4927.38P值0.020.010.01

項目nNGFNT-3老年正常組482.52±1.020.85±0.21老年耳聾組721.24±0.490.53±0.14t值8.798.96P值0.040.04

項目n鈣蛋白酶鈣蛋白酶mRNA老年正常組4848.62±9.562.32±0.46老年耳聾組7267.54±11.047.37±0.71t值14.1110.03P值0.030.04

3 討論

目前醫(yī)學界將老年開始出現(xiàn)的，雙耳對稱的，逐漸遞進的神經(jīng)性耳聾稱為老年性耳聾。老年性耳聾是指隨著年齡的增長，老年人聽覺器官慢慢老化，耳蝸組織內(nèi)各項指標漸漸出現(xiàn)異常表達，會逐漸出現(xiàn)聽力減弱，嚴重者甚至聽力喪失的一種老年性疾病，一般60歲以上的老年人60%以上都會出現(xiàn)不同程度的聽力減弱，一般多表現(xiàn)為雙側(cè)感音神經(jīng)性耳聾，以高頻聽力減弱為主，言語分辨率降低，出現(xiàn)重振、耳鳴等現(xiàn)象[4-5]?，F(xiàn)今隨著人口老齡化的日趨嚴重，老年性耳聾患者數(shù)量也日趨升高，迄今為止尚沒有確切的方法治療老年性耳聾，但良好的生活習慣可以預(yù)防老年性耳聾的發(fā)生[6]。

TNF-α是目前醫(yī)學界發(fā)現(xiàn)的活性最強的抗腫瘤細胞因子,所以少量的TNF-α是有殺滅癌細胞的作用。TNF-α可以作用于多種細胞，可以誘導IL-1β、IL-6、IL-8在人體內(nèi)的分泌，從而導致白細胞、毛細血管組織的損壞，最終對全身器官及組織造成損害[7]。IL-1β由單核細胞、成纖維細胞及內(nèi)皮細胞等多種細胞分泌，在人體中分布廣泛，可以同免疫球蛋白超家族的受體結(jié)合，促使集落刺激因子、血小板生長因子的產(chǎn)生，并誘導T細胞分泌IL-2，在人體免疫應(yīng)答以及組織修復過程中起著重要作用[8]。IL-6由單核細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞等多種瘤細胞分泌產(chǎn)生，可以促進免疫細胞的分化增殖，并提高其功能，是參與重要炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)之一。IL-6可以有效上調(diào)細胞G蛋白活性及中性粒細胞功能，并促使細胞凋亡。TNF-α、IL-1β、IL-6同屬于炎性因子[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年耳聾組耳蝸TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平均明顯高于老年正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明TNF-α、IL-1β、IL-6可能與老年性耳聾有密切關(guān)系。sVCAM-1屬于IgSF成員，在血管內(nèi)皮細胞中有較高表達，和VLA-4作用后可以穿透血管壁到達炎癥部位，還可以與T-B細胞發(fā)生反應(yīng)。VE-cadherin可以維持血管內(nèi)皮細胞功能的完整性，VE-cadherin可以通過連環(huán)蛋白，達到保持細胞連續(xù)性的目的[10-11]。HMGB1在哺乳動物細胞中廣泛存在，屬于高度保守的核蛋白，有良好的促炎作用，成為了目前醫(yī)學界近年來研究的熱點之一。本研究發(fā)現(xiàn)，老年耳聾組耳蝸sVCAM-1、VE-cadherin、HMGB1表達水平均明顯低于老年正常組(P<0.05)，說明sVCAM-1、VE-cadherin、HMGB1可能與老年性耳聾有密切關(guān)系，或許會成為治療老年性耳聾的新靶點。NGF可以促進中樞神經(jīng)元的生長、發(fā)育，維持神經(jīng)系統(tǒng)功能的正常運行，可以修復神經(jīng)功能的損傷[12]。NT-3是人體中最為重要的生長因子，可以刺激及控制神經(jīng)，保護耳蝸神經(jīng)元,目前神經(jīng)營養(yǎng)因子-3多被用于構(gòu)建組織神經(jīng)支架[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年耳聾組NGF、NT-3蛋白含量顯著低于老年正常組(P<0.05)，說明耳蝸NGF蛋白及NT-3蛋白含量在老年性耳聾中存在異常表達，對診斷治療老年性耳聾中有重要應(yīng)用價值。杜政德等[14]研究表明，老年性耳聾大鼠中NGF及NT均有異常表達，與本研究結(jié)果一致，但在其研究中，老年性耳聾大鼠NGF表達量高于本研究，可能是與所選大鼠品種不一樣有關(guān)，本研究選取的均為實驗用Wistar大鼠，研究結(jié)果可能會更加確切。鈣蛋白酶屬于降解蛋白酶的一種，鈣蛋白酶的活性受到蛋白酶激活蛋白和蛋白酶抑制蛋白的調(diào)節(jié)，可以在骨骼肌的生長過程中有重要作用，可以促使肌肉嫩化，同時鈣蛋白酶在老年耳蝸組織功能衰退及聽力減弱的過程中同樣發(fā)揮著重要的作用[15]。本研究中老年耳聾組耳蝸鈣蛋白酶及耳蝸鈣蛋白酶mRNA表達水平均明顯高于老年正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明鈣蛋白酶與老年性耳聾關(guān)系密切，其在耳蝸中高表達，會促使老年性耳聾的發(fā)生。

綜上所述，老年大鼠耳蝸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、sVCAM-1、VE-cadherin、HMGB1、NGF蛋白、NT-3蛋白、鈣蛋白酶及鈣蛋白酶mRNA均與大鼠老年性耳聾有密切關(guān)聯(lián)，其在老年大鼠耳蝸中的異常表達，對老年性大鼠耳聾的診斷、治療及預(yù)后有重要意義。