構建表達膜錨定熒光素酶的載體實現(xiàn)細胞自發(fā)光成像*

陸 琤 張 硌 張 鵬*

熒光素酶(luciferase)是一類能催化熒光素或脂肪醛氧化產(chǎn)生生物發(fā)光的一類酶。根據(jù)來源不同，熒光素酶可分為細菌熒光素酶(bacterial luciferase，BL)、螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase，F(xiàn)L)、海腎熒光素酶(renilla luciferase，RL)和其他新型低分子量熒光素酶如Gaussia熒光素酶(Gaussia luciferase，GLuc)等。

GLuc是從海洋橈足類動物Gaussia princeps中發(fā)現(xiàn)的一種熒光素酶，分子量為19.9 kD，是自然分泌的已知最小的熒光素酶[1]。GLuc的N端有17個氨基酸殘基的分泌信號肽，因此可以分泌至細胞外。GLuc可催化天然腔腸素發(fā)生發(fā)光反應，發(fā)射光波長峰值為480 nm。體內(nèi)實驗表明，GLuc產(chǎn)生光子的強度比RLuc高200倍，與FLuc產(chǎn)生的光子強度相當[2]。但GLuc發(fā)光信號衰減迅速，在一定程度上限制了其應用。使用通過密碼子優(yōu)化的GLuc，適合哺乳動物細胞表達，不僅能延長發(fā)光信號半衰期，而且能極大提升發(fā)光強度[1，3]。

構建能表達熒光素酶的細胞，相當于給細胞加上可以實時監(jiān)測的標簽，如將該細胞經(jīng)腹腔或靜脈注射小鼠體內(nèi)，當外源(腹腔或靜脈注射)給予其底物時，可在數(shù)分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，即可追蹤細胞在活體內(nèi)的位置，實現(xiàn)在無創(chuàng)條件下對體內(nèi)生物現(xiàn)象進行實時監(jiān)測[4]。但是天然的熒光素酶為分泌型，需將其錨定在細胞膜上才能指示細胞。本研究通過對密碼子優(yōu)化的GLuc進行改造，使用表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、巨噬細胞集落刺激因子受體(macrophage colony-stimulating factor receptor，MCSFR)以及廣泛存在于細胞表面的白細胞介素4受體α鏈(interleukin 4 receptorα，IL4Rα)的信號肽(signal peptide，SP)替換GLuc的信號肽，再在GLuc后加上EGFR、MCSFR及IL4Rα跨膜結構域(transmembrane domain，TMD)，并在其3'末端加上終止密碼子。如此設計的目的序列，能使表達的GLuc錨定在細胞表面，從而實現(xiàn)指示細胞位置的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

采用Tanon 5200型全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(中國天能公司)；0.22 m型濾器(美國PALL公司)；超濾離心管(美國Millipore公司)；包裝質(zhì)粒PMD和SPA為本實驗室保存，載體質(zhì)粒PCDH-X本實驗室保存。DNA片段GLuc-EGFR、GLuc-MCSFR、GLuc-IL4Rα的合成及將其分別插入到PCDH-X載體質(zhì)粒上由蘇州泓訊生物科技股份有限公司完成。293TX細胞為本實驗室保存；永生化外周血來源巨噬細胞iBloodMC為本實驗室構建。熒光素酶底物Coelenterazine購自Nanolight公司；Lipofectamine2000購自Invitrogen Life Technologies公司；高糖培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；血清購自Hyclone；其余常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 表達膜錨定熒光素酶慢病毒載體構建

目標序列設計方法：用廣泛存在于細胞表面的人源EGFR、MCSFR及IL4Rα的SP替換GLuc的SP，除去GLuc3'端的終止密碼子，在其后再加上EGFR、MCSFR及IL4Rα跨膜結構域(transmembrane domain，TMD)，并在其3'末端加上終止密碼子，目的序列設計完成。用全基因合成的方法將目的序列插入PCDH-X載體的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點之間，載體名稱分別為PCDH-GLuc-EGFR、PCDHGLuc-MCSFR及PCDH-GLuc-IL4Rα，目的序列結構見圖1。

1.3 表達膜錨定熒光素酶的慢病毒包裝

293TX細胞于對數(shù)生長期時接種于60 mm直徑的皿中，用含10%血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將1 μg PMD、3 μg SPA、4 μg PCDH-X、PCDH-GLuc-EGFR、PCDH-GLuc-MCSFR及PCDH-GLuc-IL4Rα分別與100 μl無血清1640溫和混勻，16μl Lipofectamine 2000與100 μl無血清1640溫和混勻，室溫靜置5 min后將二者混勻，室溫靜置20 min，將混合液緩慢滴入293TX細胞中，即完成病毒包裝。病毒包裝后8 h或過夜后換液，24～36 h收一次上清，補液5 ml。約72 h后再收上清，以3000 r/min，離心5 min，使得細胞及雜質(zhì)沉淀，取上清用0.22 μm濾器過濾后加入Millipore超濾離心管，以5000 r/min，離心20 min，獲得約200 μl濃縮病毒，置于-40 ℃保存或立刻使用。

1.4 永生化外周血來源巨噬細胞培養(yǎng)及感染

取少量永生化小鼠外周血來源巨噬細胞iBloodMC，接種至12孔板中的4孔，分別加入PCDH-X、PCDHGLuc-EGFR、PCDH-GLuc-MCSFR和PCDHGLuc-IL4Rα濃縮病毒約20 μl，感染72 h左右，加入嘌呤霉素篩選感染成功的細胞，終濃度為5 ng/ml。篩選3～4 d后更換培養(yǎng)液。待感染成功的細胞長滿后，在倒置熒光顯微鏡下觀察后將其擴大培養(yǎng)。4種細胞分別命名為iBloodMC CON、iBloodMC GLuc-EGFR、iBloodMC GLuc-MCSFR和iBloodMC GLuc-IL4Rα。

1.5 細胞體外成像檢測

將處于對數(shù)生長期的iBloodMC GLuc細胞，鋪入96孔板中，每種細胞各鋪一個孔，每孔約鋪1×104個細胞。每孔加入100 μl培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸出50 μl培養(yǎng)上清移入下一排的孔中，使細胞及其培養(yǎng)上清上下對應，其余培養(yǎng)上清棄之，PBS漂洗細胞3遍。加入熒光素酶發(fā)光底物，終濃度為50 μM，混勻，等待1 min后使用發(fā)光成像系統(tǒng)檢測。

2 結果

2.1 慢病毒感染永生化小鼠外周血來源巨噬細胞結果

由于載體PCDH能表達綠色熒光蛋白，因此慢病毒感染成功的細胞在熒光顯微鏡下均應發(fā)綠光。實驗中慢病毒感染成功的細胞經(jīng)熒光顯微鏡鏡檢均顯示為綠色熒光，見圖2。

圖2 慢病毒感染成功細胞熒光顯微鏡下圖(×20)

2.2 發(fā)光成像結果

將4種細胞及其培養(yǎng)上清加入熒光素底物后，使用Tanon 5200全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)成像，iBloodMC GLuc-EGFR、iBloodMC GLuc-MCSFR和iBloodMC GLuc-IL4Rα均能表達熒光素酶。其中，iBloodMC GLuc-EGFR熒光素酶表達量最高，且膜錨定效果最好；iBloodMC GLuc-IL4Rα熒光素酶表達量次之，膜錨定效果與iBloodMC GLuc-EGFR相比稍差；iBloodMC GLuc-MCSFR熒光素酶表達量較少，見圖3。

圖3 四種表達熒光素酶細胞發(fā)光成像圖

3 結論

生物發(fā)光常見于一些特定的細菌、昆蟲和海洋生物中，其過程是通過熒光素酶催化底物熒光素產(chǎn)生發(fā)光反應，具有非放射性、反應靈敏、操作簡單、結果準確、無毒副作用等優(yōu)點，因而廣泛應用于分子生物學、醫(yī)學等研究領域[6-7]。如將熒光素酶基因融合哺乳動物表達載體，并包裝成病毒感染腫瘤細胞穩(wěn)定表達，使該腫瘤細胞成為發(fā)光源，用其建立新型的腫瘤動物模型，能夠通過活體成像系統(tǒng)實時、無創(chuàng)地監(jiān)控腫瘤的生長和轉移[8-10]。

GLuc是熒光素酶的一種，在多種哺乳動物細胞中均能高效的分泌表達，且其催化底物產(chǎn)生發(fā)光反應不需要三磷酸腺苷(adenosin triphosphate，ATP)參與，即不需要裂解細胞提供ATP，可在保持細胞完整的情況下，通過檢測GLuc從而監(jiān)測細胞的情況，且檢測過程方便快捷。因此，本實驗研究選用GLuc來實現(xiàn)細胞自發(fā)光。

本研究通過慢病毒感染的方法將高斯熒光素酶基因整合至永生化的小鼠外周血來源巨噬細胞中，且通過改造該熒光素酶基因，利用廣泛表達于細胞表面的3種受體，使其不能分泌至細胞外而錨定在細胞膜上。當在培養(yǎng)細胞的孔里和細胞培養(yǎng)上清中分別加入熒光素酶底物，如存在GLuc，GLuc催化底物反應，用成像系統(tǒng)拍攝出來呈黑色，黑色越深，GLuc含量越高。實驗結果顯示，在iBloodMC Gluc-hEGFR的細胞培養(yǎng)上清中幾乎檢測不到GLuc，而在培養(yǎng)該細胞的孔中能檢測到GLuc，且顏色較深。若GLuc存在于細胞內(nèi)，由于熒光素酶底物不能透過活細胞膜進入細胞內(nèi)與GLuc反應，因此這些GLuc不可能存在于細胞內(nèi)，而是被錨定在細胞膜表面。從這三種細胞及細胞培養(yǎng)上清顯示的黑色深淺表明，iBloodMC Gluc-hEGFR分泌的GLuc最多，且細胞自發(fā)光成像效果最好，iBloodMC Gluc-IL4Rα次之，iBloodMC Gluc-MCSFR最差，后續(xù)實驗不可采用。而iBloodMC Gluc-EGFR、iBloodMC Gluc-IL4Rα由于自發(fā)光成像效果較好，后續(xù)可工程化改造成可用于治療特定疾病的細胞，當將該細胞注射入體內(nèi)時，可通過GLuc實時監(jiān)測治療細胞的位置，為有效監(jiān)測該治療細胞在體內(nèi)的情況提供一種可靠的方法。