響應(yīng)面法優(yōu)化雨生紅球藻產(chǎn)蝦青素培養(yǎng)條件

李嘉儀，竇勇，邵蓬，高金偉，賈旭穎，張文慧，王祎哲，馬婷，周文禮

（天津農(nóng)學(xué)院 天津市漁業(yè)資源與環(huán)境研究室，天津 300384）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種淡水單細(xì)胞藻類(lèi)。當(dāng)雨生紅球藻細(xì)胞受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，會(huì)轉(zhuǎn)變成厚壁孢子狀態(tài)，其特征主要表現(xiàn)為細(xì)胞進(jìn)入孢囊期，鞭毛慢慢脫落，運(yùn)動(dòng)速度降低直至不游動(dòng)，色素由核周?chē)饾u向四周擴(kuò)散，由綠色最終變?yōu)榧t色[1-2]。紅色酮類(lèi)胡蘿卜素蝦青素（3，30-二羥基-β，β-胡蘿卜素-4，40-二酮）是最強(qiáng)大的生物抗氧化劑，研究表明，蝦青素可能在抗抑郁和預(yù)防 UVA誘導(dǎo)所致的皮膚老化方面有一定效果[3-6]。當(dāng)雨生紅球藻細(xì)胞處于脅迫條件下，如營(yíng)養(yǎng)缺乏，高輻射或高鹽濃度時(shí)，蝦青素以脂肪?；鶈熙セ蚨サ男问疆a(chǎn)生[7]。目前，雨生紅球藻是天然蝦青素的最佳來(lái)源，占細(xì)胞干重的4%[8-10]。

雨生紅球藻積累蝦青素的關(guān)鍵是脅迫條件，脅迫條件顯著影響積累蝦青素的含量。齊安翔等[11]研究表明，環(huán)境因子脅迫條件下，雨生紅球藻由綠色營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞快速轉(zhuǎn)變?yōu)楹癖阪咦?，并積累蝦青素。才金玲等[12]認(rèn)為，高光照強(qiáng)度使雨生紅球藻光合作用和氮類(lèi)化合物的代謝反應(yīng)減弱，藻細(xì)胞出現(xiàn)脅迫應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)與蝦青素合成的有關(guān)基因被激活，胞內(nèi)開(kāi)始合成并積累蝦青素。光照脅迫應(yīng)激下，能使雨生紅球藻中蝦青素的合成量增高并保護(hù)光合色素，但當(dāng)光照應(yīng)激程度超過(guò)雨生紅球藻抵抗范圍，細(xì)胞就會(huì)受到損傷而降低蝦青素的產(chǎn)量[13]。鹽脅迫是雨生紅球藻合成蝦青素常用的技術(shù)方法之一，探究適宜的鹽濃度范圍對(duì)雨生紅球藻高效合成蝦青素有重要研究意義[14]。Cordero等[15]研究表明，2% NaCl是蝦青素生產(chǎn)的最佳鹽度，鹽度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致雨生紅球藻大量死亡。Boussiba等[16]研究表明，光照強(qiáng)度、磷酸鹽和鹽脅迫會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，降低分裂速率，但會(huì)積累大量蝦青素。有研究認(rèn)為，雨生紅球藻在缺氮條件下，細(xì)胞分離速度降低，會(huì)形成厚壁孢子并積累蝦青素[17]。本文以光照強(qiáng)度、NaCl和NaNO3為脅迫條件，優(yōu)化雨生紅球藻蝦青素積累的環(huán)境因子組合，旨在為雨生紅球藻大規(guī)模培養(yǎng)并大量積累蝦青素提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雨生紅球藻的培養(yǎng)

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）來(lái)源于天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。使用BBM培養(yǎng)基培養(yǎng)[11]，培養(yǎng)溫度設(shè)定（22±1）℃，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞階段光強(qiáng)設(shè)定為2 000～2 200 lx，每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶數(shù)次，防止細(xì)胞附壁或下沉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雨生紅球藻的脅迫處理?xiàng)l件

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的雨生紅球藻離心（4 000 r/min，10 min），得到的藻細(xì)胞用不含有NaNO3和NaCl的新鮮BBM培養(yǎng)基沖洗兩次，將得到的不含NaNO3和NaCl的雨生紅球藻細(xì)胞密度調(diào)整到5×104cell/mL，進(jìn)行脅迫試驗(yàn)。通過(guò)前期試驗(yàn)培養(yǎng)確定NaNO3濃度為0、0.13和0.25 g/L；NaCl濃度為0、2.5和5.0 g/L；光照強(qiáng)度為5 000、7 000和9 000 lx，以光照強(qiáng)度（A）、NaNO3濃度（B）和 NaCl濃度（C）等因素作為考察對(duì)象，以蝦青素含量（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)，共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（中心點(diǎn)重復(fù)5次，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差），以獲取最優(yōu)脅迫條件參數(shù)。

1.2.2 蝦青素含量的測(cè)定

取出5 mL藻液進(jìn)行離心，棄去上清液，加入5 mL超純水清洗，重復(fù)兩次。然后用5 % KOH＋30%甲醇破壞葉綠素5 min，棄去上清液后加 5 mL超純水清洗兩次。棄去上清液，收集到藻體中，加入2 mL丙酮，用細(xì)胞破碎儀處理10 min，4 ℃離心15 min（10 000 r/min），保留上清液，重復(fù)以上操作，直至藻團(tuán)呈白色，色素提取完全為止。

蝦青素含量采用公式[18]:

Astaxanthin（mg /L）＝4.6×A480ast×稀釋倍數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)蝦青素含量所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用 Duncan’s 多重比較檢驗(yàn)均值的差異顯著性，差異顯著性水平為0.05。利用EXCEL 2007進(jìn)行繪圖。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用 Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken方法的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)線(xiàn)性擬合，通過(guò)擬合后線(xiàn)性關(guān)系制作預(yù)測(cè)結(jié)果等高線(xiàn)和響應(yīng)曲面圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面分析

選用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方法[19-23]，將光照強(qiáng)度、NaNO3濃度和NaCl濃度進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素和水平見(jiàn)表1，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)總共17組Box-Behnken響應(yīng)面分組，得到蝦青素含量見(jiàn)表2，將所得表2中數(shù)據(jù)通過(guò) Design-Expert軟件擬合方程[24-25]，擬合得到回歸方程如下:

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素和水平編碼

表2 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

對(duì)回歸方程Y進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3，該擬合模型有顯著性（P＜0.05），由系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，方程A-A（P＜0.01）和C-C（P＜0.01）對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素含量的線(xiàn)性效應(yīng)極顯著，而B(niǎo)-B則不顯著（P＞0.05）。3種脅迫對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素含量影響效果為C＞A＞B。二次項(xiàng)中C2（P＜0.05）有顯著影響。模型中A、C因素均對(duì)蝦青素含量有顯著影響，交互項(xiàng)A和B、A和C、B和C均有影響，但不顯著（P＞0.05），因此，可認(rèn)為3種脅迫方式對(duì)蝦青素產(chǎn)生交互式影響較小。F值為5.15意味著該模型具有重要意義，僅2.09%的可能性是由于失擬概率產(chǎn)生的“模型F值”。說(shuō)明該擬合符合實(shí)際，該模型能較準(zhǔn)確反映光照強(qiáng)度、NaNO3濃度和NaCl濃度對(duì)雨生紅球藻脅迫高產(chǎn)蝦青素的效果。

表3 擬合曲線(xiàn)模型方差分析結(jié)果

擬合曲線(xiàn)方差分析結(jié)果中相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4，其中決定系數(shù)R2＝0.868 9，校正系數(shù)RAdj＝0.700 2，通過(guò)換算不到0.03%變異模型不能由此模型解釋?zhuān)砻髟撃Ｐ团c實(shí)際擬合相符。當(dāng)Adeq測(cè)量精度大于 4時(shí)是可用的，該模型中 Adeq測(cè)量精度為8.316，表明該模型可以用于設(shè)計(jì)并預(yù)測(cè)脅迫條件對(duì)雨生紅球藻高產(chǎn)蝦青素的結(jié)果。

表4 擬合曲線(xiàn)模型方差分析結(jié)果

從上述方差結(jié)果可以得到，通過(guò)模型可以較好地?cái)M合3種不同脅迫條件對(duì)雨生紅球藻高產(chǎn)蝦青素的效果，為了更加體現(xiàn)研究具體數(shù)值較優(yōu)脅迫效果，使用Design-Expert軟件對(duì)3種不同脅迫條件對(duì)雨生紅球藻高產(chǎn)蝦青素含量進(jìn)行等高線(xiàn)以及響應(yīng)面圖制作并進(jìn)行分析。

響應(yīng)曲面圖和等高線(xiàn)圖可以直觀(guān)表示試驗(yàn)因素的3個(gè)水平間與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系，獲取試驗(yàn)設(shè)計(jì)中最優(yōu)工藝參數(shù)。從圖1中可以看出，當(dāng)NaCl濃度為2.5 g/L時(shí)，光照強(qiáng)度和氮濃度交互作用對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素含量的影響。這兩個(gè)因素交互作用不顯著，隨著光照強(qiáng)度和 NaNO3濃度降低，蝦青素含量緩慢提高，當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到9 000 lx和NaNO3為0 g/L條件下，相互交互效果最佳。

圖1 因素A和B交互作用的等高線(xiàn)和響應(yīng)面

NaNO3濃度為0.13 g/L時(shí)，光照強(qiáng)度和NaCl濃度交互作用對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素含量的影響，這兩個(gè)因素交互作用顯著，從圖2中可以看出，NaCl濃度在1.25～2.50 g/L時(shí)脅迫效果最佳，鹽濃度越高積累蝦青素效果越差。

圖2 因素A和C交互作用的等高線(xiàn)和響應(yīng)面

光照強(qiáng)度為7 000 lx時(shí)，NaCl和NaNO3交互作用對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素含量的影響，兩因素交互作用不顯著，NaCl濃度為2.5 g/L、NaNO3為0.13 g/L時(shí)，積累蝦青素含量最高為5.0 mg/L（圖3）。

圖3 因素B和C交互作用的等高線(xiàn)和響應(yīng)面

3 討論

由于雨生紅球藻中蝦青素在脅迫條件下積累明顯，因而絕大多數(shù)采用脅迫條件處理方法，但不同脅迫條件和脅迫程度對(duì)積累蝦青素效果會(huì)有較大差別。研究雨生紅球藻實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)蝦青素一直是本行業(yè)的重要課題。本研究通過(guò)利用RSM（響應(yīng)面法）允許響應(yīng)面的可視化表示作為定位最大點(diǎn)的直接手段，并且通過(guò)適當(dāng)計(jì)算機(jī)程序的可用性，數(shù)學(xué)操作被簡(jiǎn)化為常規(guī)程序，篩選積累蝦青素的條件來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)蝦青素這一目的。這種統(tǒng)計(jì)方法可以很容易地應(yīng)用于大多數(shù)微藻及其產(chǎn)品，這為RSM應(yīng)用于任何藻類(lèi)發(fā)酵過(guò)程開(kāi)辟了道路，以?xún)?yōu)化關(guān)鍵參數(shù)并實(shí)現(xiàn)最大的藻類(lèi)生長(zhǎng)[13]。Niizawa等研究雨生紅球藻在氮饑餓條件下，光照強(qiáng)度達(dá)到110 μmol/（m2·s）時(shí)，蝦青素濃度增加至干生物量的2.7 %，并在應(yīng)激階段有效利用光能[26-27]。蝦青素是藻類(lèi)細(xì)胞中的主要葉黃素，這些葉黃素在培養(yǎng)條件下作為藻類(lèi)細(xì)胞中的脂肪酸酯存在。光照水平對(duì)蝦青素積累率有重要影響。Saeki等還發(fā)現(xiàn)加入 NaCl促進(jìn)這些游離和酯型葉黃素的合成，較高的光和鹽脅迫協(xié)同激活藻細(xì)胞中的胡蘿卜素生成[28]。在氮缺乏和高光條件下，鹽的補(bǔ)充會(huì)增強(qiáng)培養(yǎng)物中酯化的蝦青素、玉米黃質(zhì)的合成。

4 結(jié)論

光照強(qiáng)度和NaCl對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素有極顯著影響（P＜0.01）；NaCl濃度為 2.5 g/L、NaNO3為0 g/L、光照為9 000 lx時(shí)，雨生紅球藻積累蝦青素含量最高，達(dá)6.80 mg/L。