草莓莖尖組培消毒方法及激素配比的優(yōu)選

連朋，杜夢卿，王麗娟

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津300384）

我國草莓（Fragaria ananassaDuchesne）總產(chǎn)量和栽培面積位居世界第一[1]，其市場需求量巨大，在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中草莓育苗多采用匍匐莖繁殖，這種方法易使草莓感染病菌，導(dǎo)致種性退化，果實(shí)變小，畸形果比例增多，口感逐漸變差等[2]，目前，組培快繁技術(shù)是解決這一問題的有效途徑之一。關(guān)于草莓組培快繁研究的較多，例如Ko等以‘桃園1號’等臺灣品種草莓的莖尖為外植體，利用次氯酸鈉對剝開外葉包裹的莖尖進(jìn)行消毒，成活率超過了80%[3]；Paredes以智利草莓莖尖為外植體，利用酒精、抗氧化劑和次氯酸鈉消毒，污染率可小于20%，將莖尖接種在含有6-芐氨基腺嘌呤＋吲哚丁酸的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，誘導(dǎo)率達(dá)到80%，后期增殖系數(shù)達(dá)到10以上，生根率達(dá)到90%[4]；田芳等以‘章姬’草莓莖尖為外植體，利用酒精、升汞消毒，在MS＋6-BA＋NAA培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)率為 56.7%，最高增殖系數(shù)達(dá)到5.5，生根率達(dá)到95%[5]，以及楊波等[6]利用‘京藏香’草莓和張黎鳳等[7]利用‘紅顏’草莓進(jìn)行草莓組培試驗(yàn)，采用的消毒方法和激素處理均有所偏差。根據(jù)前人研究結(jié)果來看，在外植體消毒和植物激素濃度配比等方面存在較大差異，其原因可能與不同基因型草莓品種存在差異所致。

因此，本試驗(yàn)試材為引進(jìn)的日本草莓品種‘香野’，取其莖尖為外植體，通過對外植體消毒處理、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等階段進(jìn)行研究，篩選出外植體的最佳消毒方法，分析比較不同培養(yǎng)階段激素的適宜添加量，為解決草莓種性退化、拓寬品種組培關(guān)鍵技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用草莓莖尖取自天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院試驗(yàn)基地。次氯酸鈉（NaClO）、噻苯隆（TDZ）、萘乙酸（NAA）及MS培養(yǎng)基所需各種化學(xué)物質(zhì)，均由天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院設(shè)施實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒

取生長健壯、無病蟲害的草莓匍匐莖（留取頂端2～4 cm）于燒杯中，加入少量洗衣粉和水浸泡 5 min后，置于流水沖洗 0.5 h，加 2～3滴Tween-80浸泡5 min，再用流水沖洗0.5 h，將沖洗干凈的匍匐莖轉(zhuǎn)移到超凈工作臺上，用無菌水沖洗3次，75%乙醇浸泡消毒30 s后無菌水沖洗3次。用2%、5%、10%次氯酸鈉（NaClO）浸泡消毒5、10、15 min，9個處理標(biāo)記為H1～H9，消毒后用無菌水沖洗4次。剝?nèi)∫严竞玫馁橘肭o生長點(diǎn)（0.3～0.5 mm），接種于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（MS＋TDZ 1.0 mg/L＋NAA 0.1mg/L＋瓊脂7 g/L＋蔗糖30 g/L，pH 5.8）上，每個處理重復(fù)3次，每次重復(fù)接種10瓶，每瓶接種3個莖尖。培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為（25±1）℃，光照時間設(shè)置為16 h/d，光照強(qiáng)度設(shè)置為 39.49 μmol/（m2·s）。

污染率＝污染莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100%

褐化率＝褐化莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100%

成活率＝誘導(dǎo)成活莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100%

1.2.2 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

剝?nèi)⊥ㄟ^ H7處理方法已消毒好的匍匐莖生長點(diǎn)接種于添加不同濃度TDZ（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/L）和0.1 mg/L NAA的MS誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（瓊脂7 g/L＋蔗糖30 g/L，pH 5.8），6個處理標(biāo)記為T1～T6。每個處理重復(fù)3次，每次重復(fù)接種10瓶，每瓶接種3個莖尖。接種培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)莖尖誘導(dǎo)分化率、生長勢。生長勢由最早誘導(dǎo)分化時間以及分化芽數(shù)決定[8]。

誘導(dǎo)分化率＝萌發(fā)芽的莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100%

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)

把誘導(dǎo)分化出的草莓叢生芽切分開，接種于添加不同濃度 TDZ（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/L）和0.2 mg/L NAA的MS繼代增殖培養(yǎng)基（瓊脂7 g/L＋蔗糖30 g/L，pH 5.8）上，6個處理記為Q1～Q6。每個處理重復(fù)3次，每次重復(fù)接種10瓶，每瓶接種3個莖尖。接種培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)各處理的增殖系數(shù)及生長勢。

增殖系數(shù)＝接種培養(yǎng)30 d后叢生芽總數(shù)／接種初期叢生芽總數(shù)

1.2.4 生根培養(yǎng)

將3～4 cm生長健壯的草莓組培苗轉(zhuǎn)接到MS和 NAA含量不同的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)（表1），其中瓊脂為7 g/L，蔗糖為30 g/L，pH 5.8。每個處理重復(fù)3次，每次重復(fù)接種10瓶，每瓶接種4個莖尖。接種培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)各處理的生根率、根部干鮮重及根系活力。

表1 生根培養(yǎng)基配方

生根率＝接種30 d的生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%

根系活力采用TTC法測量[9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所獲數(shù)據(jù)運(yùn)用 SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對外植體消毒效果的影響

不同消毒處理對外植體消毒效果的影響情況見表2。外植體的污染率隨次氯酸鈉濃度的增加及消毒時間的增加而降低，其中H1處理的污染率極顯著高于其他處理，H9處理的污染率極顯著低于其他處理。外植體的褐化率隨著次氯酸鈉濃度的增加以及消毒時間的增加而升高，其中H1處理的褐化率與 H2處理差異不顯著，顯著低于其他處理， H9處理的褐化率極顯著高于其他處理。H7、H4、H5處理成活率顯著高于其他處理，3個處理在污染率方面，H4處理極顯著高于H7處理，與H5處理差異不顯著，H5處理顯著高于H7處理；褐化率方面，H7處理顯著高于 H4處理，與 H5處理差異不顯著；成活率方面，H7處理成活率最高，達(dá)到64.44%，但3個處理間差異不顯著。

表2 不同消毒處理對外植體消毒效果的影響

2.2 不同激素處理對草莓莖尖誘導(dǎo)分化的影響

不同濃度激素處理對草莓莖尖誘導(dǎo)分化的影響見表3。

表3 不同激素配比對莖尖誘導(dǎo)分化的影響

由表3可知，隨著TDZ濃度的升高，外植體誘導(dǎo)分化率升高，分化速度加快，但是長勢減弱。T3、T4、T5、T6處理的誘導(dǎo)分化率均極顯著高于T1、T2處理；T4處理的誘導(dǎo)分化率顯著高于其他處理，達(dá)到67.78%，且莖尖分化快，芽數(shù)多，長勢較旺盛；T5、T6處理的莖尖分化速度快，分化芽數(shù)多，長勢弱；T3處理的莖尖分化速度快，分化芽數(shù)較多，長勢旺盛；T2處理的莖尖分化慢，分化芽數(shù)較少，長勢較旺；T1處理的莖尖分化慢，芽數(shù)少，長勢最弱。因此通過誘導(dǎo)分化率和生長勢確定草莓外植體誘導(dǎo)分化最適宜培養(yǎng)基配方為MS＋TDZ 1.00 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，該處理下誘導(dǎo)分化率達(dá)67.78%。

2.3 不同激素處理對草莓叢生芽繼代增殖的影響

不同激素處理對草莓叢生芽繼代增殖的影響情況見表4。

表4 不同激素配比對莖尖繼代增殖的影響

由表4可見，隨著TDZ濃度升高，叢生芽增殖數(shù)量增多，增殖系數(shù)增大，長勢越旺，但是TDZ濃度達(dá)到1.0 mg/L，組培苗長勢開始減弱并且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。Q6處理的增殖系數(shù)極顯著高于其他處理，但是該處理組培苗長勢弱，玻璃化現(xiàn)象最嚴(yán)重；Q5處理的增殖系數(shù)顯著高于Q4、Q3、Q2、Q1處理，但該處理長勢弱并且玻璃化現(xiàn)象明顯；Q4、Q3處理的增殖系數(shù)顯著高于Q2、Q1處理，且二者之間差異不顯著，Q4處理長勢旺但有玻璃化現(xiàn)象，Q3處理長勢旺且沒有玻璃化現(xiàn)象；Q2、Q1處理的增殖系數(shù)極顯著小于其他處理。因此，通過增殖系數(shù)和生長勢確定草莓叢生芽增殖最適宜培養(yǎng)基配方為 MS＋TDZ 0.75 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，該處理下增殖系數(shù)達(dá)到4.11，且長勢旺盛。

2.4 不同培養(yǎng)基濃度及激素濃度對草莓組培苗生根培養(yǎng)的影響

不同培養(yǎng)基濃度及激素濃度對草莓生根培養(yǎng)的影響情況見表5。不同培養(yǎng)基濃度及激素濃度處理下組培苗生根率大小依次是 Z2＞Z6＞Z5＞Z4＞Z1＞Z3，其中 Z2處理顯著高于其他處理，為98.33%；在根鮮重、根干重、根系活力方面，Z2處理均極顯著大于其他處理，其中生長于添加NAA培養(yǎng)基上的組培苗，即 Z2、Z4、Z6處理的根鮮重、根干重、根系活力顯著高于生長于未添加NAA培養(yǎng)基的組培苗即Z1、Z3、Z5處理。因此最適宜草莓組培苗生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基是 MS＋NAA 0.1 mg/L，該處理下草莓組培苗生根率達(dá)到98.33%。

表5 不同培養(yǎng)基濃度及激素濃度對生根培養(yǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以‘香野’草莓匍匐莖為試驗(yàn)試材，研究了其組培快繁技術(shù)。含氯消毒劑在水中形成次氯酸，作用于菌體蛋白質(zhì)起到消毒作用，而氯化汞是劇毒化學(xué)藥品，會給環(huán)境造成較大污染[10]，因此本試驗(yàn)采用次氯酸鈉作為消毒劑。外植體消毒結(jié)果表明，以草莓莖尖為外植體，采用10%次氯酸鈉浸泡消毒5 min，可以有效減小污染率和褐化率，且成活率最高為64.44%。外植體的污染率隨著次氯酸鈉濃度的增加以及消毒時間的增加而降低，而褐化率則隨著次氯酸鈉濃度的增加以及消毒時間的增加而升高，該試驗(yàn)結(jié)果與張付遠(yuǎn)等[10]采用氯化汞消毒所得結(jié)果相同，次氯酸鈉在殺死菌體的同時也使莖尖生長點(diǎn)失活，因此掌控好消毒劑濃度及消毒時間是外植體消毒的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)中誘導(dǎo)分化培養(yǎng)結(jié)果表明，草莓外植體誘導(dǎo)分化最適宜培養(yǎng)基配方為 MS＋TDZ 1.00 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，此時的誘導(dǎo)率是67.78%。李海玲等[11]以‘紫金四季’草莓葉片為外植體，得出最佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基是MS＋TDZ 2.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，即適宜不同外植體誘導(dǎo)分化的激素濃度不同，由于葉片分化程度高，適宜誘導(dǎo)分化的細(xì)胞分裂素濃度也相應(yīng)的高。本試驗(yàn)中將試驗(yàn)試材接種于含更高濃度TDZ的培養(yǎng)基上時，誘導(dǎo)分化率增加，但組培苗長勢弱，而將長勢弱的組培苗轉(zhuǎn)接于低濃度的TDZ培養(yǎng)基或增加NAA濃度的培養(yǎng)基上后，組培苗長勢逐漸增強(qiáng)，推測是高濃度的TDZ會阻礙組培苗吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，或者高濃度的TDZ會降低組培苗的生理活性。

本試驗(yàn)中繼代增殖培養(yǎng)結(jié)果表明，MS＋TDZ 0.75 mg/L＋NAA 0.2 mg/L是最適宜的繼代增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達(dá)4.11。而翟婷婷等研究‘紅顏’的增殖系數(shù)為3.75[12]，所以增殖系數(shù)與品種的不同及激素的差異有關(guān)。該試驗(yàn)中Q6處理增殖系數(shù)顯著高于其他處理，但是該處理組培苗玻璃化現(xiàn)象也最為嚴(yán)重，因此提出及時轉(zhuǎn)接補(bǔ)救措施。胡穎[13]研究表明，培養(yǎng)基中瓊脂濃度、激素濃度、碳源濃度、銨根離子濃度以及培養(yǎng)箱的溫度、光照和濕度，培養(yǎng)瓶的封口膜透性也是影響草莓組培苗玻璃化率的重要影響因子。因此進(jìn)一步探究‘香野’草莓組培苗出現(xiàn)的玻璃化原因及其逆轉(zhuǎn)復(fù)壯措施，將是該組培快繁技術(shù)改良的內(nèi)容之一。

生根培養(yǎng)結(jié)果表明，MS＋NAA 0.1 mg/L是最適宜的生根培養(yǎng)基，生根率達(dá)到98.33%。本試驗(yàn)中MS、3/4MS和1/2MS培養(yǎng)基均能很好地誘導(dǎo)草莓組培苗根系的產(chǎn)生，這與翟婷婷等[12]研究中草莓組培苗容易生根的結(jié)論相同。翟婷婷等[12]以‘豐香’和‘章姬’草莓為試驗(yàn)材料，1/2MS培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L IBA生根效果最優(yōu)；夏瑾等[14]以‘寧玉’草莓為試驗(yàn)材料，1/2MS培養(yǎng)基中添加0.05 mg/L NAA生根效果最優(yōu)，而本試驗(yàn)以‘香野’草莓為試驗(yàn)材料，MS培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L NAA生根效果最優(yōu)，說明品種不同，最適合的生根培養(yǎng)基激素配比也不同。

綜合以上研究得出，‘香野’草莓莖尖組培中，消毒劑次氯酸鈉最適濃度為10%，最適消毒時間為5 min，最適宜莖尖誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基為 MS＋TDZ 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，最適宜叢生芽繼代增殖的培養(yǎng)基為MS＋TDZ 0.75 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，最適宜組培苗生根的培養(yǎng)基為MS＋NAA 0.1 mg/L。