櫻桃李組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究

賀祥素，柴慈江，郭靜，朱霖，王雪彤，馮濤

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津300384）

櫻桃李（Prunus cerasiferaEhrh.）為薔薇科李屬植物，俗稱野酸梅，主要分布于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁地區(qū)的野果林內(nèi)[1]。櫻桃李是一種珍貴的野生果樹資源，也是中國稀有瀕危樹種之一，被列為國家Ⅱ級重點保護物種[2]。

櫻桃李營養(yǎng)全面且價值較高[3]，某些營養(yǎng)指標甚至高于藍莓[4]，還有醫(yī)療保健價值[5-8]。櫻桃李花朵美麗，果色鮮艷，還可作為觀賞樹種在城市綠化中利用[9]。大量培育櫻桃李優(yōu)質(zhì)苗木對櫻桃李資源保護及其優(yōu)良單株的引種推廣具有重要意義。采用植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)將是快速獲得櫻桃李大量優(yōu)質(zhì)苗木的有效途徑[10]。目前，關(guān)于櫻桃李組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的研究國內(nèi)僅見少數(shù)報道。劉崇琪等對櫻桃李莖段腋芽萌發(fā)生長、增殖及葉片培養(yǎng)再生植株進行了研究[11]，李海臣等不僅研究了櫻桃李莖段腋芽萌發(fā)生長及增殖外，還對櫻桃李試管苗的生根培養(yǎng)進行了探討[12]，浦艷吉研究了影響櫻桃李莖尖培養(yǎng)的因素[13]，侍藝等對櫻桃李莖段外植體的滅菌培養(yǎng)技術(shù)進行了探討[14]。從目前研究狀況看，櫻桃李組培快繁技術(shù)距離生產(chǎn)應(yīng)用還有很長的路。本研究對櫻桃李莖段外植體滅菌、試管苗增殖、生根及移栽各個環(huán)節(jié)進行了初步探討，以便為完善櫻桃李組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗材料為種植在天津農(nóng)學(xué)院試驗園內(nèi)的櫻桃李（Prunus cerasiferaEhrh.）6年生實生苗，已開花結(jié)果。該實生苗引自新疆。生根培養(yǎng)用土為取自東校區(qū)地被植物園的黏壤土，6月份取土后裝入塑料花盆，放置在露天地表，經(jīng)一個雨季的雨水淋洗后，風(fēng)干，過1 mm篩后備用。從花卉市場購買細粒蛭石，同樣過1 mm篩備用。

1.1 櫻桃李新梢莖段滅菌中不同取材時期及酒精浸泡后處理方式的研究

不同取材時期的研究:分別于2018年5月15日和7月9日采集櫻桃李當年生新梢莖段，去掉葉片后剪成帶有2個側(cè)芽的莖段，用洗衣粉清洗后用自來水洗凈，晾干表面水分后在 70%酒精中浸泡約 10 s，然后用無菌水清洗一次，濾紙吸干表面水分后在2%次氯酸鈉溶液中浸泡25 min，無菌水清洗4次，然后將莖段接種于培養(yǎng)基中。

酒精浸泡后處理方式的研究:7月9日采集的莖段另做一個酒精浸泡后不同的處理，即用 70%酒精浸泡10 s后，不經(jīng)無菌水清洗，直接放入2%次氯酸鈉溶液中浸泡25 min，無菌水清洗4次，然后將莖段接種于培養(yǎng)基中，與上述7月9日取材并在酒精浸泡后用無菌水清洗的進行比較。

上述 2項試驗接種用培養(yǎng)基均為添加 6-BA 0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基。接種后在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為23～28 ℃，光照1 500～3 000 lx，光照時間為14 h/d。培養(yǎng)2周后調(diào)查接種莖段的污染率及萌芽狀況。

1.2 櫻桃李試管苗增殖培養(yǎng)中適宜IBA濃度篩選

在1/2MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的IBA，IBA濃度設(shè)計為6個處理:0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L，各種培養(yǎng)基中均添加15 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH調(diào)整至5.9，分裝于100 mL三角瓶中，121℃下滅菌20 min。每瓶接種4根長約1 cm的櫻桃李試管苗莖段，每處理接種7瓶共28個莖段。接種后在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同試驗1.1。培養(yǎng)20 d時調(diào)查試管苗生根率，60 d后調(diào)查試管苗莖長及繁殖系數(shù)。培養(yǎng)期間每隔20 d調(diào)查一次試管苗新生莖長，以便了解莖生長動態(tài)。

1.3 櫻桃李試管苗土壤支撐生根培養(yǎng)試驗

本項試驗設(shè)2個處理:

黏壤土支撐培養(yǎng):以方形PC瓶為培養(yǎng)瓶，將上述黏壤土與蛭石按照1∶2的體積比混和后加入培養(yǎng)瓶，每瓶加入100 mL。然后每瓶加入60 mL 培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的成分為含有0.3 ml/L IBA和15 g/L蔗糖的蒸餾水，pH 6.5。培養(yǎng)基配制完成后在121 ℃下滅菌20 min，然后在超凈工作臺中接種櫻桃李試管苗莖段，每瓶接入8根長約1 cm的櫻桃李試管苗莖段，共接種4瓶32個莖段。

瓊脂支撐培養(yǎng)（對照）:以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加0.3 mg/L的IBA和15 g/L的蔗糖，以7 g/L瓊脂做固化劑，pH為5.9，以100 mL三角瓶為培養(yǎng)容器，每瓶裝入培養(yǎng)基約40 mL，培養(yǎng)基配制完成后在121 ℃下滅菌20 min，然后在超凈工作臺中接種櫻桃李試管苗莖段，每瓶接入4根長約1 cm的櫻桃李試管苗莖段，共接種8瓶32個莖段。

上述兩處理接種后在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同試驗1.1。培養(yǎng)40 d后調(diào)查試管苗的生根率、根長、莖長、葉數(shù)等各項指標。同時在顯微鏡下觀察根毛發(fā)生狀況并拍照。

1.4 櫻桃李試管苗移栽試驗

將試驗 1.3中黏壤土支撐培養(yǎng)和瓊脂支撐培養(yǎng)中生根的櫻桃李試管苗，在進行根系長度的測定后裸根移栽入黏壤土與蛭石體積比為1∶1的移栽基質(zhì)中，移栽后用塑料薄膜覆蓋保濕并放于向陽的室內(nèi)，室內(nèi)溫度為20～30 ℃，移栽3周后調(diào)查試管苗成活率。

上述各項試驗中，對調(diào)查的各項百分率指標用卡平方測驗獨立性，其他各項指標均按照完全隨機試驗單向分組資料的統(tǒng)計分析方法做方差分析，并用鄧肯氏新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時期對櫻桃李新梢莖段滅菌培養(yǎng)效果的影響

由表1可見，5月15日和7月9日兩個時期采集的櫻桃李新梢莖段，用酒精和次氯酸鈉滅菌后的污染率無顯著差異，均低于10%。莖段的褐化率和萌芽率也無顯著差異，褐化率低于5%，萌芽率為100%。上述結(jié)果表明，5月中旬和7月上旬兩個采集時期對滅菌效果無明顯影響。這兩個時期采集櫻桃李新梢莖段，用酒精和次氯酸鈉滅菌均可 達到理想的滅菌效果。

表1 取材時期對櫻桃李新梢莖段滅菌效果的影響

2.2 酒精浸泡后處理方式對櫻桃李新梢莖段滅菌效果的影響

由表2可見，無菌水洗與不水洗兩個處理莖段的污染率、褐化率與萌芽率等指標均無顯著差異，污染率均低于10%、褐化率均低于5%，而萌芽率均為100%。上述結(jié)果表明，對于櫻桃李新梢莖段，在用酒精（70%）浸泡后與用次氯酸鈉（2%）浸泡前，用無菌水沖洗與否對滅菌效果無明顯影響。因此，為了簡化滅菌程序，在用酒精和次氯酸鈉對櫻桃李新梢莖段滅菌時，酒精浸泡后可以不用無菌水沖洗莖段，直接將莖段放入次氯酸鈉中浸泡滅菌。圖1為酒精浸泡后兩種方式處理的櫻桃李莖段滅菌培養(yǎng)狀況。

表2 酒精浸泡后處理方式對櫻桃李新梢莖段滅菌效果的影響

圖1 酒精浸泡后處理方式對櫻桃李莖段滅菌培養(yǎng)效果的影響

2.3 IBA濃度對櫻桃李試管苗增殖的影響

由表3可見，不同濃度IBA各處理之間的莖長存在顯著性差異，但是表現(xiàn)并不規(guī)律。IBA濃度為0.3 mg/L處理的莖長顯著高于0.1 mg/L和0.2 mg/L兩個濃度處理，但與對照無顯著差異。IBA濃度為0.4 mg/L和0.5 mg/L兩個處理的莖長與0.3 mg/L處理無顯著差異，但均顯著高于其他3個處理。各處理繁殖系數(shù)也存在顯著差異，其變化規(guī)律與莖長相似。IBA濃度為0.3、0.4和0.5 mg/L 3個處理的繁殖系數(shù)差異不顯著。0.4 mg/L的處理顯著高于對照及0.1、0.2 mg/L兩個處理。綜合上述結(jié)果，以IBA濃度為0.4 mg/L的處理為最佳處理，形成的莖長最長，繁殖系數(shù)最高為4.2。由于本試驗培養(yǎng)周期為60 d，按照4.2的繁殖系數(shù)，接種1個莖段一年內(nèi)僅可獲得約5 500個莖段，繁殖速度還不是很快。因此，繁殖系數(shù)還有必要進一步提高。

表3 不同IBA濃度對櫻桃李試管苗增殖的影響

試驗觀察到，接種后20 d時各處理莖生長均不明顯，接種后20～60 d莖的生長有逐漸加快的趨勢（圖2）。

圖2 櫻桃李試管苗莖段接種后萌生新莖的生長動態(tài)

另外，試驗中觀察到，接種后培養(yǎng)20 d時，各處理生根率基本達到最大，但此時莖段基本沒有萌芽生長。各處理均是先發(fā)根，后萌芽生長。沒有生根的莖段也沒有萌芽，個別莖段甚至最后枯死。由此看來，新生莖的生長與生根關(guān)系密切，為促進繁殖系數(shù)的提高，關(guān)鍵在于提高生根率。從本試驗各處理生根率來看，除對照外均在 50%左右（表3），因此生根率還有很大的提高空間。從表3還可以看到，雖然IBA濃度為0.3、0.4 mg/L時的生根率較高，但與其他各處理及對照均無明顯差異，說明本試驗中添加IBA對櫻桃李莖段的根系發(fā)生沒有明顯的促進作用。如何提高櫻桃李莖段的生根率尚待進一步研究。

綜合上述分析，IBA濃度為0.4 mg/L的處理為本試驗最佳處理，繁殖系數(shù)最高，可達4.2。繁殖系數(shù)的進一步提高將依賴于生根率的提高。

本試驗中各處理所形成的試管苗生長健壯，莖粗葉大，將對后期的生根培養(yǎng)十分有利（圖3）。

2.4 櫻桃李試管苗土壤支撐生根培養(yǎng)效果

由表4可見，以黏壤土做培養(yǎng)基支撐物的處理的生根率為 68.8%，顯著高于瓊脂做培養(yǎng)基支撐物的處理，根長、莖長及葉數(shù)與瓊脂支撐培養(yǎng)的無顯著差異，兩個處理的萌芽率無顯著差異。上述結(jié)果表明，與瓊脂支撐生根培養(yǎng)對照相比，黏壤土做培養(yǎng)基支撐物可以明顯促進櫻桃李試管苗根系的發(fā)生（圖4）。

表4 土壤做培養(yǎng)基支撐物對櫻桃李試管苗生根培養(yǎng)的影響

圖4 兩種培養(yǎng)基中櫻桃李試管苗的生根狀況

通過顯微鏡對根表面的觀察，黏壤土支撐培養(yǎng)的櫻桃李試管苗的根表面生有大量根毛，而瓊脂支撐培養(yǎng)的根表面基本無根毛的發(fā)生（圖5）。

圖5 兩種培養(yǎng)基中櫻桃李試管苗的根毛發(fā)生狀況

綜合上述分析，與瓊脂支撐培養(yǎng)對照相比，以黏壤土做培養(yǎng)基支撐物進行櫻桃李試管苗的生根培養(yǎng)，可以明顯提高生根率，而且根表面生有根毛，同時可以降低成本，因此黏壤土做培養(yǎng)基支撐物是櫻桃李試管苗生根培養(yǎng)的較佳處理。

2.5 櫻桃李試管苗移栽效果

由表5可見，黏壤土支撐培養(yǎng)中獲得的櫻桃李試管苗的移栽成活率為 75%，顯著高于瓊脂支撐培養(yǎng)中獲得的試管苗。分析其原因，一方面可能是黏壤土支撐物中生根的試管苗對移栽后的土壤基質(zhì)適應(yīng)性較強的緣故。另一方面，黏壤土中生根的試管苗生有大量根毛，增強了根系的吸收能力，因此有利于成活率的提高。對此尚待進一步研究。

表5 櫻桃李試管苗移栽效果

3 討論與結(jié)論

外植體滅菌接種以獲得無菌莖芽是植物離體快速繁殖的首要環(huán)節(jié)。酒精（70%）是外植體常用的滅菌劑之一。酒精除了自身具有殺菌作用外，還可以濕潤外植體表面，排除外植體表面的空氣，利于其他滅菌劑的滲入[15]。因此，在使用其他滅菌劑浸泡滅菌之前，一般先用酒精浸泡一定時間。而且在酒精浸泡后，通常要用無菌水沖洗后再放入其他滅菌劑中浸泡[16-19]。但有一些研究中用酒精浸泡后沒有用無菌水沖洗[20-21]。本項結(jié)果中酒精浸泡后使用無菌水沖洗與否對櫻桃李莖段的滅菌效果無明顯影響，因此可以在酒精浸泡后免去無菌水沖洗環(huán)節(jié)，使櫻桃李莖段滅菌過程得以簡化。

侍藝等研究表明，使用次氯酸鈉做主要滅菌劑對櫻桃李水培枝萌發(fā)嫩莖和5月下旬采集的新梢莖段有很好的滅菌效果[14]。本項研究中，對 7月上旬采集的櫻桃李新梢莖段用次氯酸鈉滅菌效果與5月份采集的無顯著差異，而且污染率均低于10%，萌芽率達到100%，再次證明以次氯酸鈉做主要滅菌劑可以獲得令人滿意的結(jié)果。同時也表明櫻桃李新梢莖段外植體的取材適期可以由 5月份延長至7月上旬。

木本植物試管苗增殖的主要方式是促進腋芽發(fā)枝和單芽莖段扦插[10]。目前的研究中櫻桃李試管苗的增殖多采用促進腋芽發(fā)枝的方式。但是這種方式形成的叢生芽缺乏明顯的加長生長，會對后期的生根培養(yǎng)造成一定影響。浦艷吉等在培養(yǎng)基中加入0.03 mg/L GA3對叢生芽的伸長起到了一定的促進作用[13]。單節(jié)莖段扦插增殖方式一般形成一個單軸延伸的莖，增殖與生根同時進行，形成的試管苗也較健壯。在葡萄、棗等多種木本植物試管苗增殖中常用單節(jié)莖段扦插的方式[22-23]。本項研究表明，在含有IBA 0～0.5 mg/L的1/2MS培養(yǎng)基中櫻桃李試管苗均可以形成單軸延伸的莖，而且試管苗莖粗葉大，個別莖長可達10 cm，平均莖長則以IBA濃度為0.4 mg/L的處理最長，繁殖系數(shù)也以該處理最高，達到4.2。盡管這一繁殖系數(shù)不是很高，但是試管苗生長健壯，有利于后續(xù)的生根培養(yǎng)。因此，此種增殖方式在進一步提高繁殖系數(shù)后有望成為櫻桃李試管苗較好的增殖方式。

櫻桃李試管苗的生根培養(yǎng)目前都是在瓊脂培養(yǎng)基中進行的[11-13]。以土壤做培養(yǎng)基支撐物進行試管苗的生根培養(yǎng)，可以明顯降低試管苗成本，提高生根質(zhì)量，而且有利于移栽成活，已經(jīng)在珠美海棠、栒 子等多個樹種上試驗成功[24-25]。以土做培養(yǎng)基支撐物還可以將試管苗的生根培養(yǎng)放在溫室中[26-28]甚至露地環(huán)境中進行[29-30]，從而進一步降低成本。本項結(jié)果以黏壤土做培養(yǎng)基支撐物進行櫻桃李試管苗生根培養(yǎng)，生根率顯著高于瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)的試管苗，試管苗生有根毛，移栽成活率也顯著高于瓊脂培養(yǎng)基中的試管苗，這與柴慈江等人的研究結(jié)果基本一致[24-25]。

因此，本項研究初步得出以下結(jié)論:2018年5月15日和7月9日取櫻桃李新梢莖段，用70%酒精和2%次氯酸鈉滅菌，取材時期對滅菌培養(yǎng)效果無明顯影響，這兩個時期取材污染率均低于10%、萌芽率均達100%；酒精浸泡后用無菌水沖洗與否對滅菌效果無明顯影響；在含有0.4 mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d櫻桃李試管苗繁殖系數(shù)為4.2；在黏壤土做支撐物的培養(yǎng)基上櫻桃李試管苗的生根率為 68.8%，顯著高于瓊脂培養(yǎng)基；土壤支撐培養(yǎng)的櫻桃李試管苗的移栽成活率為75%，顯著高于瓊脂支撐培養(yǎng)的試管苗（33.3%）。