牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中miR-143互作lncRNA-HZ5的鑒定及其相互調(diào)控作用分析

王軼敏，張蔚然，張俊星，劉新峰，郭宏，丁向彬

（天津農(nóng)學院 動物科學與動物醫(yī)學學院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

肌肉的分化和生長發(fā)育過程是內(nèi)在遺傳、表觀遺傳和外在各種信號互作的結果，骨骼肌發(fā)育分化過程涉及多基因的表達、信號途徑及網(wǎng)絡式調(diào)控，過程極其復雜，其中非編碼 RNA（noncoding RNA，ncRNA）的調(diào)控作用受到越來越多的重視。microRNAs（miRNAs）與 long non-codingRNA（lncRNA）是兩種重要的非編碼RNA，在肌肉發(fā)育中的調(diào)控作用研究日益深入。miRNAs是一類長度較短的非編碼 RNA，主要通過與靶基因mRNA結合發(fā)揮調(diào)控作用。lncRNA是一類長度大于 200 nt的非編碼 RNA，越來越多的研究表明lncRNA參與調(diào)控了細胞、組織分化和發(fā)育及疾病發(fā)生等多種生物學過程[1-3]。已有研究表明，miRNAs[4]和 lncRNA[5-7]在肌肉發(fā)育和肌細胞增殖與分化中均發(fā)揮了關鍵性的調(diào)控作用。lncRNA發(fā)揮調(diào)控作用的機制非常復雜，不僅可直接調(diào)控基因的表達，還能與 miRNAs間互相調(diào)控。在人和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，肌肉特異性表達的 lncRNA linc-MD1中存在與miR-133和miR-135互補結合的核酸序列，linc-MD1可以通過吸附miR-133和miR-135進而影響轉錄因子MAML1和MEF2C的表達，使肌肉特異性表達的基因激活，最終影響肌細胞的發(fā)育和分化[7]。目前，大多數(shù)lncRNA與miRNAs間的互相調(diào)控作用機制尚不明確，在牛肌衛(wèi)星細胞成肌分化中相關長鏈非編碼RNA的研究報道還比較少。鑒于這種情況，前期研究中我們通過RNA-seq技術，對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化過程中差異表達的lncRNA進行了篩選，并對前期研究中發(fā)現(xiàn)的對牛成肌分化過程具有調(diào)控作用的 miR-143[8]進行了針對性的生物信息學預測分析，找到了與miR-143具有潛在靶向關系的差異表達lncRNA，本研究從這些預測的靶l(wèi)ncRNA出發(fā)，選取表達豐度較高、分化前后差異倍數(shù)較大的 lncRNA進行研究，尋找 miR-143的互作lncRNA，分析miR-143及其互作lncRNA在牛肌衛(wèi)星細胞中的相互作用關系，以便更深入地了解牛肌肉發(fā)育和肌細胞增殖分化中的非編碼RNA調(diào)控機制，為肉牛分子育種和肌損傷修復研究提供一定的參考。

1 材料

1.1 試劑

miR-143模擬物（mimic）、miR-143抑制劑（inhibitor）、lncRNA的siRNA購自廣州銳博生物技術有限公司；Opti-MEM? Medium、TRIzol、胎牛血清（FBS）、馬血清（HS）購自 Life Technologies Corporation；Luciferase assay system購自美國Promega公司；X-tremeGENE Transfection Reagent購自Roche公司；Fast Digest Xho I內(nèi)切酶、Fast Digest Not I內(nèi)切酶、DMEM高糖培養(yǎng)基購自Thermo scientific公司；兔抗IGFBP5抗體購自武漢博士德公司；鼠抗 GAPDH、HRP標記的 goat anti-rabbit IgG、goat anti-mouse IgG二抗抗體購自北京中杉金橋公司；高靈敏ECL發(fā)光試劑購自上海生工生物工程有限公司；膠原酶Ⅱ購自 Sigma Aldrich Corporation；0.25%胰蛋白酶溶液、RIPA buffer購自北京索萊寶科技有限公司；反轉錄試劑盒購自Takara biotechnology Corporation；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit、All-in-OneTMqPCR Mix購自GeneCopoeia；Taq酶預混液及DNA Marker購自北京康為世紀生物科技有限公司。psiCHECK-2TMvector（Promega，Madison，WI）由北京畜牧獸醫(yī)研究所饋贈。

1.2 儀器

Light Cycler? 96實時熒光定量PCR儀（Light Cycler 96），瑞士 Roche公司； Nano-Drop ND 2000c Spectrophotometer、酶標儀 Varioskan Flash Multimode Reader，德國 Thermo scientific公司；PowerPac Basic電泳儀、Mini-Protean Tetra、MiniTyans-Blot Cell、電泳凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc XRS＋，美國 Bio-Rad公司；細胞恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋電機公司。

2 方法

2.1 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的培養(yǎng)和誘導分化

牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的培養(yǎng)和成肌誘導分化方法根據(jù)本實驗室已建立的方法進行[8-10]。采用膠原酶和胰酶聯(lián)合消化法分離肌衛(wèi)星細胞，將5月齡牛胎兒的后肢肌肉用眼科剪充分剪碎，用 5 mL 0.2%膠原酶II在37℃水浴鍋中消化1 h，0.25%胰酶消化30 min，將上述混合液依次過100目、200目和 400目細胞篩，離心收集細胞后用培養(yǎng)基重懸，接種到培養(yǎng)皿中，在含有 20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待細胞生長至80%融合時，加入含有2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基進行體外成肌誘導分化。

2.2 預測互作lncRNA與miR-143的結合位點分析

登陸 NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），使用序列比對功能，將牛 miR-143成熟體序列與預測互作lncRNA序列進行比對，分析二者間可能的靶向結合位點。

2.3 雙熒光素酶試驗驗證 miR-143對預測互作lncRNA的靶向調(diào)控作用

以預測互作lncRNA中包含miR-143靶向結合位點的序列為中心，前后各擴增一定長度，構建到psiCHECK-2載體的XhoI（上游）和NotI（下游）位點之間，引物見表1。然后分別與miR-143 mimic共轉293T細胞，48 h后進行雙熒光素酶檢測。雙熒光素酶表達載體的構建及雙熒光素酶試驗具體操作根據(jù)本實驗室已建立的雙熒光素酶試驗方法進行[8,10]。

表1 miR-143靶向結合位點雙熒光酶表達載體構建引物序列

2.4 miR-143模擬物或抑制劑、lncRNA-HZ5 siRNA轉染牛骨骼肌衛(wèi)星細胞

miR-143 mimic、miR-143 inhibitor或lncRNAHZ5 siRNA及各自的陰性對照根據(jù)試劑說明書推薦濃度，采用miR-143 mimic及陰性對照終濃度50 nmol/L、miR-143 inhibitor及陰性對照終濃度100 nmol/L、lncRNA-HZ5 siRNA及陰性對照終濃度50 nmol/L進行轉染。轉染方法按照本實驗室已建立的方法進行[11]。轉染24 h后采用qRT-PCR技術檢測肌衛(wèi)星細胞中miR-143及l(fā)ncRNA的表達變化。

2.5 qRT-PCR檢測肌衛(wèi)星細胞中 miR-143及l(fā)ncRNA-HZ5的表達變化

提取轉染了miR-143模擬物、miR-143抑制劑、陰性對照24 h后肌衛(wèi)星細胞的RNA，以及轉染了lncRNA-HZ5 siRNA及陰性對照24 h后肌衛(wèi)星細胞的 RNA。將 RNA反轉錄成 cDNA，通過qRT-PCR技術檢測過表達和抑制miR-143表達后lncRNA-HZ5的表達變化，以及干擾lncRNA-HZ5表達后肌衛(wèi)星細胞中miR-143的表達變化。RNA反轉錄及 qRT-PCR檢測根據(jù)本實驗室已建立的方法進行[8,10]。GAPDH作為lncRNA-HZ5qRT-PCR檢測內(nèi)參，qRT-PCR引物見表2。5.8s rRNA作為miR-143 qRT-PCR檢測內(nèi)參，qRT-PCR引物見表3。

表2 lncRNA-HZ5 qRT-PCR檢測引物序列

表3 miR-143 qRT-PCR檢測引物序列

2.6 蛋白提取及Western Blot檢測

在35 mm皿中培養(yǎng)牛骨骼肌衛(wèi)星細胞，利用RIPA蛋白裂解液裂解并收集轉染 lncRNA-HZ5 siRNA及陰性對照24 h后牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的全蛋白質。蛋白含量測定及Western Blot操作參照本實驗室已建立的方法進行[8,10]。在進行蛋白質SDS-PAGE電泳試驗時，蛋白上樣量為40 μg，上樣蛋白分別與兔抗IGFBP5一抗（1∶200）和鼠抗GAPDH一抗（1∶500）4 ℃條件下孵育過夜，然后與用TBST稀釋的二抗（HRP標記的goat antirabbit IgG、goat anti-mouse IgG二抗）在室溫下孵育1 h，將膜在室溫下暴露于增強型化學發(fā)光（ECL）試劑中2 min。使用Image Lab 5.0軟件（Bio-Rad）進行條帶強度的檢測和定量。通過將目的條帶灰度除以來自相同樣品上相同印跡上的內(nèi)參蛋白灰度，將條帶歸一化。

2.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料分析以均值±標準差（x±sd）表示，通過t檢驗比較試驗組與對照組試驗差異，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 預測互作lncRNA與miR-143的結合位點分析

結合前期 RNA-seq結果，從預測的與miR-143有互作關系的 lncRNA中選取表達豐度較高、分化前后差異倍數(shù)較大的兩個 lncRNA（lncRNA-HZ5和lncRNA-HZ8）進行研究。lncRNAHZ5位于 8號染色體（54766532-54771384），lncRNA-HZ8位于 13號染色體（78161275-78162698），miR-143位于7號染色體（62809304-62809404），兩條lncRNA與miR-143都不存在位置上的重疊。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫對兩條lncRNA與miR-143序列進行比對，發(fā)現(xiàn)miR-143的種子序列與lncRNA-HZ5有2個結合位點（圖1A），與lncRNA-HZ8有1個結合位點（圖1B）。

圖1 miR-143與預測互作lncRNA靶向結合位點分析

3.2 雙熒光素酶試驗驗證 miR-143對預測互作lncRNA的靶向調(diào)控作用

miR-143與lncRNA-HZ5和lncRNA-HZ8具有互補的結合位點，推測miR-143可能通過類似調(diào)控 mRNA的方式靶向調(diào)控 lncRNA-HZ5和lncRNA-HZ8。為驗證miR-143是否直接靶向調(diào)控lncRNA-HZ5和 lncRNA-HZ8，本研究將lncRNA-HZ5及l(fā)ncRNA-HZ8中包含miR-143靶向結合位點的一段序列克隆到 psiCHECK-2載體中，然后分別與 miR-143的模擬物共轉染 293T細胞，48 h后進行雙熒光素酶試驗檢測，結果見圖2，由圖可知，共轉染 miR-143模擬物和lncRNA-HZ5第二個 miR-143靶向結合位點psiCHECK-2載體后，海腎熒光素酶相對活性顯著下調(diào)，但第一個靶向結合位點及l(fā)ncRNA-HZ8靶向結合位點psiCHECK-2載體與miR-143模擬物共轉染后海腎熒光素酶相對活性未發(fā)生明顯改變，說明miR-143能夠靶向調(diào)控lncRNA-HZ5，但不能靶向調(diào)控lncRNA-HZ8。

圖2 雙熒光素酶驗證miR-143與預測互作lncRNA之間的靶向調(diào)控關系

3.3 miR-143表達改變對肌衛(wèi)星細胞中 lncRNAHZ5的影響

雙熒光素酶試驗結果表明，miR-143對lncRNA-HZ5具有靶向調(diào)控作用，但miR-143在牛肌衛(wèi)星細胞中對lncRNA-HZ5的直接調(diào)控作用還需進一步驗證。故本研究將miR-143模擬物、miR-143抑制劑及陰性對照分別轉染牛骨骼肌衛(wèi)星細胞，轉染 24 h后提取 RNA，檢測過表達miR-143或抑制miR-143表達對lncRNA-HZ5的影響。結果顯示，與對照相比，過表達 miR-143后 lncRNA-HZ5的表達量顯著降低，而抑制miR-143表達后lncRNA-HZ5的表達量顯著升高（圖3），試驗結果說明，在牛肌衛(wèi)星細胞中miR-143能夠調(diào)控lncRNA-HZ5的表達。

圖3 miR-143表達改變后對肌衛(wèi)星細胞中l(wèi)ncRNA-HZ5表達的影響

3.4 干擾肌衛(wèi)星細胞中l(wèi)ncRNA-HZ5對miR-143及其靶基因的影響

為探究lncRNA-HZ5是否調(diào)控miR-143，本研究利用 siRNA干擾 lncRNA-HZ5的表達，qRT-PCR檢測 miR-143的表達變化，發(fā)現(xiàn)干擾lncRNA-HZ5后內(nèi)源miR-143的表達顯著下調(diào)（圖4 A），進一步采用 Western blot技術檢測了miR-143靶基因 IGFBP5的表達水平，發(fā)現(xiàn)干擾lncRNA-HZ5后IGFBP5的蛋白水平顯著上調(diào)（圖4 B），說明lncRNA-HZ5對miR-143的表達具有調(diào)控作用。

圖4 干擾肌衛(wèi)星細胞中l(wèi)ncRNA-HZ5表達對miR-143及其靶基因IGFBP5的影響

4 討論

lncRNA發(fā)揮調(diào)控作用的機制非常復雜，不但可以直接調(diào)控基因的表達，還能與 miRNAs間互相調(diào)控。由于多數(shù)lncRNAs與mRNA的結構類似，mircoRNAs可通過類似作用于mRNA的方式調(diào)控lncRNAs。研究顯示，H19與 let-7e、let-7g和 let-7i有部分序列互補，并被這些 miRNAs下調(diào)[12]。miRNA let-7b能降低人宮頸癌細胞中l(wèi)incRNA-p21的穩(wěn)定性[13]，還能導致 lncRNA HOTAIR的穩(wěn)定性降低[14]。LOC285194作為 p53調(diào)控的腫瘤抑制基因，是結腸癌細胞系HCT-116中miR-211的靶標[15]。此外，lncRNA與miRNAs間還有其他三種調(diào)控方式:一是，lncRNAs可作為miRNAs的前體發(fā)揮作用[16]。二是，lncRNA可作為 miRNAs的分子海綿發(fā)揮吸附作用，這種lncRNAs被稱為競爭性內(nèi)源 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）[7,17]。三是，lncRNAs能夠與mRNA結合并掩蓋mRNA與miRNAs的結合位點，阻礙miRNAs對mRNA的抑制或降解作用，從而保證 mRNA能夠正常翻譯[18]。目前，肌肉發(fā)育中l(wèi)ncRNA與miRNAs互相調(diào)控的機制研究仍處于初步探索階段，大多數(shù)lncRNA與 miRNAs間互相調(diào)控作用的機制尚不明確。鑒于這種情況，在前期研究中，我們通過RNA-seq及生物信息學技術，鑒定出了與miR-143可能存在互作關系的lncRNA，本研究從這些靶 lncRNA中選擇表達豐度較高的lncRNA-HZ5和lncRNA-HZ8作為候選互作 lncRNA進行后續(xù)研究。兩個預測互作lncRNA中均含有miR-143的靶向結合位點，提示miR-143可能是通過調(diào)控靶基因的類似方式來調(diào)控lncRNA。因此，本研究將包含miR-143靶向結合位點的部分lncRNA序列構建到psiCHECK-2載體中，與miR-143的模擬物共轉染到293T細胞中，進行雙熒光素酶驗證，發(fā)現(xiàn)miR-143能夠直接調(diào)控 lncRNA-HZ5。隨后，在肌衛(wèi)星細胞中對miR-143進行表達調(diào)控后檢測lncRNA-HZ5的表達變化，發(fā)現(xiàn)在牛肌衛(wèi)星細胞中miR-143能夠調(diào)控lncRNA-HZ5的表達。為探究lncRNA-HZ5是否調(diào)控miR-143，本研究檢測了干擾lncRNA表達之后miR-143的表達量改變，發(fā)現(xiàn)干擾lncRNAHZ5后內(nèi)源 miR-143的表達顯著下調(diào)，說明lncRNA-HZ5對miR-143的表達具有調(diào)控作用，進一步檢測miR-143靶基因IGFBP5的表達水平，發(fā)現(xiàn)干擾lncRNA-HZ5后IGFBP5的蛋白水平顯著上調(diào)。上述研究結果表明，miR-143與 lncRNAHZ5在牛肌衛(wèi)星細胞中具有相互調(diào)控作用。而我們已發(fā)表的試驗結果表明，miR-143可通過靶向調(diào)控其靶基因 IGFBP5的表達進而調(diào)控牛肌衛(wèi)星細胞增殖與分化過程，過表達miR-143會抑制肌衛(wèi)星細胞的成肌分化[8]；對lncRNA-HZ5在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化中的調(diào)控作用研究表明，抑制lncRNA-HZ5的表達可促進牛肌衛(wèi)星細胞的成肌分化過程[11]。由于miR-143負調(diào)控lncRNA-HZ5的表達，過表達miR-143相當于抑制了lncRNAHZ5的表達，對成肌分化的調(diào)控作用好像產(chǎn)生了矛盾，但本試驗結果提示，lncRNA-HZ5應該是通過調(diào)控 miR-143的表達進而發(fā)揮其調(diào)控作用的，干擾lncRNA-HZ5后內(nèi)源miR-143的表達顯著下調(diào)，使miR-143的靶基因IGFBP5表達水平上調(diào)，最終促進了肌衛(wèi)星細胞的成肌分化過程；而過表達miR-143能夠抑制lncRNA-HZ5，理論上能夠促進肌衛(wèi)星細胞的成肌分化過程，但外源miR-143的表達水平改變倍數(shù)較高（已發(fā)表研究結果中miR-143的過表達水平約為47倍[8]），可能掩蓋了內(nèi)源miR-143表達水平改變的作用，而外源miR-143表達水平的提高顯著抑制了其靶基因IGFBP5的表達，進而抑制了成肌分化過程。綜合本研究和已發(fā)表研究結果分析，lncRNA-HZ5調(diào)控牛肌衛(wèi)星細胞成肌分化可能是通過調(diào)控miR-143來發(fā)揮作用的，miR-143可以通過與lncRNA-HZ5互作影響牛成肌分化過程。本研究結果可以為牛肌肉發(fā)育和肌細胞增殖分化中的非編碼RNA調(diào)控機制研究提供一定的參考。