組培復幼對珠美海棠生理及組織結構的影響

郜偉，周文麗，崔瑞瑞，楊松林，高英

（天津農學院 園藝園林學院，天津 300384）

復幼是指將成熟老態(tài)的細胞或者器官恢復到幼嫩狀態(tài)的重要技術手段[1]，植物是否幼嫩對其生長發(fā)育等多個方面有著重要的影響，包括植物的生根能力、生長態(tài)勢、通直生長狀態(tài)、繁殖能力、以及對惡劣環(huán)境的抵抗程度等[1]。通常情況下，植物幼態(tài)時期的生根能力和繁殖能力極強，但是隨著植物的生長發(fā)育，生根能力和繁殖能力會逐漸降低[2]。因此采取一定的科學技術手段對植物進行復幼生長，其對木本植物的繁殖具有重大意義。自1954年人們發(fā)現(xiàn)可以誘導常春藤復幼開始，木本植物的復幼技術便受到了極大的關注[3]，科學家在復幼領域開展了大量的研究，對植物器官的表觀特征、細胞的顯微、亞顯微結構、生理代謝變化、基因表達等各個領域都進行了探討和研究，并取得了一些成果[4-8]。

珠美海棠（Malus zumi）是薔薇科蘋果屬植物，具有極強的抗寒能力和耐鹽堿性質，同時也具有較強的耐旱性[9-10]，可以在寒冷地區(qū)和鹽堿地區(qū)廣泛種植。且樹形優(yōu)美漂亮，是一種經濟實用的觀賞性樹木。同時，珠美海棠與多種蘋果品種嫁接，可在大多數(shù)的鹽堿地區(qū)栽培，對于擴大蘋果樹的栽種面積，提高蘋果品質具有極大的意義。本研究通過珠美海棠組培復幼研究，對于提高其繁殖能力和繁殖系數(shù)方面具有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以天津農學院實驗樓前的成齡珠美海棠為母樹，采集半木質化的枝條作為初代組培苗進行復幼組織培養(yǎng)的外植體。采集繼代次數(shù)為 0（外植體上的葉片）代，1、3、5、7代在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d的植株葉片放入自封袋中，并冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 珠美海棠的組織培養(yǎng)

以 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，從樹齡相同的多年生珠美海棠母樹上選取長勢相同的當年生枝條的莖尖做為組培的外植體，建立無菌體系。之后進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基仍以 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，加入2 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，每次繼代時間為30 d，每次繼代取前一次繼代增殖產生的莖段為材料，連續(xù)繼代7次，觀察復幼增殖的情況，并取樣進行生理指標的測定和組織結構的觀察。

1.2.2 可溶性糖含量的測定

采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[11]，用電子天平精準地稱量各代珠美海棠的葉片0.5 g，每種植物葉片各稱取3份進行重復，剪碎混勻后分別放入大試管中，每只試管加入15 mL蒸餾水，然后在沸水浴中煮沸20 min后取出冷卻，將冷卻后的液體過濾倒入100 mL的容量瓶并定容。測量時取1 mL提取液加入蒽酮試劑（50 mL水中緩慢倒入200 mL 98%濃硫酸，待完全冷卻后加入0.05 g蒽酮）5 mL，在620 nm波長下用空白調零，測定其吸光度值。

1.2.3 可溶性蛋白的測定

采用考馬斯亮藍法測定葉片中蛋白質的含量[11]。

酶液蛋白質含量（mg/g FW）=C×V/W×a

C為查標準曲線所得每管蛋白質含量（mg）；V為提取液總體積（mL）；a為測定所取提取液體積（mL）；W為取樣量（g）。

1.2.4 組織結構的觀察

利用石蠟切片法進行組織結構的觀察。石蠟切片制備按常規(guī)方法進行，取材料放入FAA固定液中，固定24 h以上。固定后的材料利用梯度酒精進行逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。之后進行修塊，用切片機切片，烘箱烘干，二甲苯脫蠟，梯度酒精逐級復水，進行番紅染色6～8 h，蒸餾水漂洗，70%、80%、95%酒精各脫水1 min，固綠染色1 min，95%酒精、無水乙醇、酒精二甲苯混合液各2 min，二甲苯5 min，脫水透明處理。中性樹脂膠封片，電子顯微鏡下觀察，并拍照記錄不同放大倍數(shù)下莖、葉結構圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010和SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同代數(shù)珠美海棠葉片中可溶性蛋白含量的變化

由圖1可知，0代珠美海棠中可溶性蛋白含量為0.033 mg/g；1代珠美海棠中可溶性蛋白的量為0.034 mg/g；之后隨繼代次數(shù)的增加，可溶性蛋白含量呈下降趨勢，繼代培養(yǎng)第7代時珠美海棠中可溶性蛋白的含量最低，為0.027 mg/g。但培養(yǎng)5代之前各代的可溶性蛋白含量差異不顯著，第 7代與其他各代相比可以達到顯著水平。

圖1 復幼后各代珠美海棠葉片中可溶性蛋白含量

2.2 不同代數(shù)珠美海棠葉片可溶性糖含量的變化

通過試驗對復幼后各代珠美海棠葉片內可溶性糖含量測定，并進行顯著性分析，其含量變化如圖2所示。從圖中可知，0代珠美海棠葉中可溶性糖含量為0.006 8 g/100g；1代珠美海棠葉中可溶性糖含量為0.007 2 g/100g；隨繼代次數(shù)的增加可溶性糖含量逐漸遞減，第7代珠美海棠葉中可溶性糖含量為0.006 1 g/100g，達到各代培養(yǎng)的最低水平。分析可知，0代和3代之間沒有顯著性差異；5代和7代之間沒有顯著性差異；0代和1代之間具有顯著性差異且1代中含量比0代中的含量略有增加。從整體上看，復幼后珠美海棠葉片中的可溶性糖含量呈現(xiàn)減少趨勢。

圖2 復幼后各代珠美海棠葉片中可溶性糖含量

2.3 不同繼代次數(shù)組培苗葉片及莖的組織結構比較

2.3.1 不同繼代次數(shù)組培苗葉片組織結構的變化

圖3為不同繼代次數(shù)珠美海棠組培苗葉片的組織結構橫切圖。如圖3可知，0代、1代柵欄組織明顯，1代較0代的柵欄組織減少，3代和5代柵欄組織明顯較0代和1代減少，但仍能觀察到柵欄組織，7代柵欄組織最少，較難觀察。各繼代次數(shù)葉片海綿組織沒有明顯變化。0代、1代上表皮細胞排列整齊且細胞壁較厚，3代、5代、7代上下表皮細胞均有增大，表皮細胞壁變薄。維管組織0代葉最發(fā)達，隨著繼代次數(shù)的增加，維管束在葉中所占比例減小。

圖3 不同繼代次數(shù)珠美海棠組培苗葉橫切面結構圖

2.3.2 不同繼代次數(shù)組培苗莖組織結構的變化

圖4為不同繼代次數(shù)珠美海棠組培苗莖橫切面結構圖。由圖4可以看出，0代莖橫切顯微結構表皮細胞排列緊密整齊，表皮細胞壁較厚，皮層薄壁細胞小且較少，木質部明顯排列緊密整齊，木質化程度較高，韌皮層較寬，髓部細胞形狀較規(guī)則，髓射線較清晰。1代莖與0代相比，表皮細胞壁變薄，皮層薄壁細胞增多，木質部明顯減少且排列疏松，木質化程度降低，韌皮部沒有明顯變化。3代、5代、7代莖表皮細胞壁變薄，表皮細胞增大，皮層薄壁細胞增大，細胞層增厚，木質部減少，細胞排列疏松，韌皮層稍有減少。髓細胞形狀不規(guī)則，髓射線不明顯。

圖4 不同繼代次數(shù)珠美海棠組培苗莖橫切面結構圖

3 討論

3.1 組培復幼對植物葉片中可溶性糖的影響

植物器官內可溶性糖的變化會對植物葉片的生理適應性產生一系列的影響，主要表現(xiàn)在抗寒、抗旱、耐鹽堿等對不良環(huán)境的抵抗能力等方面[12-15]。復幼后珠美海棠葉片中的可溶性糖經過測定和顯著性差異分析可知:0代和 3代間沒有顯著性差異；0代和1代之間具有極顯著性差異，且呈現(xiàn)增加趨勢；5代、7代和0代相比具有極顯著性差異；5代和7代之間沒有顯著性差異；從總體上來看，葉片中可溶性糖含量1代與0代相比為增加，而自第3代開始，逐代呈下降趨勢。文佳等研究了樹齡對油茶葉中可溶性糖的含量變化，表明隨著樹齡的增加葉片中可溶性糖的含量顯著增加[16]，本試驗結果表明，珠美海棠葉片內的可溶性糖含量隨繼代次數(shù)的增加而降低，這和前人研究的變化結果相符。但在本試驗中復幼第1代珠美海棠葉片中的可溶性糖含量出現(xiàn)一次上升，導致這種情況的具體原因尚不明確，還有待進一步研究。

3.2 組培復幼對植物葉片中可溶性蛋白的影響

植物體內可溶性蛋白的含量與植物的抗寒性有很大的關聯(lián)，可溶性蛋白的含量和植物抗寒能力強弱呈現(xiàn)正比關系[17]。復幼后各代珠美海棠葉片中的可溶性蛋白含量幾乎沒有顯著性差異，直到復幼到第7代時葉片內的可溶性蛋白才與0代中的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)顯著性差異。根據(jù)本試驗的數(shù)據(jù)推測，復幼對珠美海棠葉片內的可溶性蛋白含量變化影響不大，且變化趨勢不明顯。也可能是由于本試驗中復幼代數(shù)較少，未能得出復幼與可溶性蛋白含量變化之間的關系。

3.3 不同繼代次數(shù)對組培苗組織結構的影響

刁俊明等[7]在研究不同樹齡桐花樹葉片組織結構時，將葉片海綿組織厚度、柵欄組織厚度、葉面長寬比等作為指標。結果顯示，隨樹齡的增加，葉片的柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片組織結構緊密度均呈先降后升趨勢。本試驗珠美海棠葉片結構隨繼代次數(shù)的增加柵欄組織逐漸減少，排列逐漸疏松，海綿組織沒有明顯變化，葉上下表皮細胞有增大趨勢，表皮細胞壁變薄。柵欄組織變化與刁俊明試驗結果相似，但海綿組織無明顯變化。Amissah等[18]在研究莖的結構與生根能力之間的關系時，發(fā)現(xiàn)連續(xù)的厚壁組織會阻止不定根的發(fā)生，而幼態(tài)的莖結構中厚壁組織不連續(xù)，因此生根能力較高。Ballerster[8]在研究板栗幼齡期和成熟期體外生根過程莖顯微結構變化中，幼體和成熟枝條在切除時具有相似的莖結構，主要區(qū)別在于木質部和韌皮部在成熟期比幼齡期發(fā)育得更好。本試驗結果與上述結果趨于一致，0代有較厚的表皮細胞壁，且木質部發(fā)達，細胞排列緊密。隨繼代次數(shù)增加表皮細胞壁變薄，木質部排列變疏松。

4 結論

通過本研究可知，隨著繼代次數(shù)的增加，珠美海棠復幼程度呈現(xiàn)逐漸加劇趨勢。因此，組培繼代培養(yǎng)可以實現(xiàn)苗木復幼的目的，對優(yōu)質苗木的生產具有較強的指導意義。