棗樹根部內(nèi)生細菌的分離及對3種棗病原真菌拮抗活性研究

邱志偉，陳有忠，于奧安，朱偉垚，楊俊林，陳招榮

（天津農(nóng)學院 園藝園林學院，天津 300384）

棗（Ziziphus jujubeMill）原產(chǎn)于我國，是我國特有的且重要的干果和特色經(jīng)濟樹種之一，是山區(qū)丘陵區(qū)發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)，與杏、桃、李、栗并稱為“五果”，是我國第一大干果樹及第七大果樹，在經(jīng)濟果樹中占有重要地位[1-2]。天津地區(qū)的棗樹種植歷史可追溯至600多年前，被廣泛種植于海河下游地區(qū)，其中以金絲小棗、冬棗等優(yōu)良品種為代表，具有耐旱、耐澇、耐鹽堿、經(jīng)濟效益高等特點，成為天津地區(qū)經(jīng)濟作物中不可或缺的一部分。早在1984年天津靜海就獲得了“中國金絲小棗之鄉(xiāng)”的美譽，在出口、加工制品等方面具有很大的發(fā)展?jié)摿3]。在種植中，棗樹病蟲害種類多、分布廣、危害嚴重是導致產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降的主要原因。據(jù)調(diào)查，當前天津地區(qū)對棗樹危害較重的病蟲害有十余種，其中病害以棗炭疽病、縮果病、棗瘋病、棗銹病等為代表[4]。目前，主要使用化學藥劑進行防治，化學防治易導致病原菌產(chǎn)生抗藥性，隨之出現(xiàn)食品安全、環(huán)境污染等問題，所以無公害的生物防治已經(jīng)成為新趨勢，天津農(nóng)學院研究開發(fā)的TJ生防菌劑，田間試驗表明對瓜類白粉病有著很好的防治效果[5]。

近年來，隨著研究的不斷深入，植物內(nèi)生菌作為潛在生防資源和外源基因載體及其所發(fā)揮的重要的生態(tài)和生理作用，在農(nóng)業(yè)及醫(yī)學領(lǐng)域中展現(xiàn)出巨大的研究價值，如何利用內(nèi)生菌逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點。研究表明，從植物各部位可分離出很多內(nèi)生菌，經(jīng)過篩選部分內(nèi)生菌對植物病害有很好的拮抗作用，為生物防治各種病害提供了基礎(chǔ)[6-10]。目前，在棗樹根部有益內(nèi)生菌篩選及其用于棗類病害生物防治這一領(lǐng)域研究不多，有著巨大的研究開發(fā)潛力。本研究擬從棗樹根部組織分離出內(nèi)生細菌，進行形態(tài)和分子鑒定，并分別以棗黑點、棗鏈格、棗輪紋的病原菌為靶標，篩選出具有拮抗作用的內(nèi)生細菌，為進一步利用內(nèi)生細菌進行生物防治提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用棗樹根部組織均采自于天津農(nóng)學院東校區(qū)二教小花園。采集的新鮮材料帶回室內(nèi)4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

抑菌測試菌株:棗黑點病病原菌仁果莖點霉（Phoma pomirumThum）和細交鏈格孢菌（Alternaria alternateKeissler）和棗輪紋病原菌葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）由天津農(nóng)學院植物病理學重點實驗室提供。

培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、LB培養(yǎng)基[11]。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生細菌的分離純化

將采集到的棗樹根部組織用清水洗凈泥沙及表面附著物，稱取0.02 g放入超凈工作臺風干水分，依次用75%乙醇溶液、3%次氯酸鈉進行表面消毒，再用無菌水沖洗3～4次，取最后一次清洗的水涂布于LB平板檢測消毒是否徹底。消毒完全后的樣本在超凈工作臺風干后，剪碎置于無菌研缽中，加入1 mL無菌水研磨成漿液。將研磨液轉(zhuǎn)移至無菌試管中，1 000 r/min離心1 min去除大部分根部組織，取上清液進行梯度稀釋10-1～10-3，每個梯度取100 μL菌液涂布于LB平板中，28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。待內(nèi)生細菌長出之后，用平板劃線法反復純化，在平板表面得到單菌落，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 革蘭氏染色

參考張嫻[12]的方法進行革蘭氏染色。

1.2.3 內(nèi)生細菌的初步鑒定

挑取內(nèi)生細菌的單菌落放于裝有液體 LB的試管中，放置于 33 ℃的搖床（200 r/min）搖培10 h。然后用 EasyPure?Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒提取DNA，方法步驟參考試劑盒說明書；提取出DNA后以此為模板進行PCR擴增，引物為細菌通用的 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3'）/1 492 R（5'-TACGGTTACCTTGTTACG ACTT-3'）。PCR 擴增體系，體系:PCR Mix 25 μL，引物 27F 1 μL，引物 1 492R 1 μL，模板 DNA 2 μL，重蒸水21 μL，總體積50 μL。擴增條件:預變性95 ℃ 5 min；變性 94 ℃ 45 s；退火 53 ℃ 40 s；延伸72 ℃ 45 s；變性、退火、延伸循環(huán)20次；終延伸72 ℃ 10 min；4 ℃保存。用凝膠電泳法檢測PCR反應結(jié)果，取3 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×DNA Loading Buffer 混合后加入1%瓊脂凝膠點樣孔中，在110 V的電壓下進行電泳。待DNA跑至凝膠中央時結(jié)束，Goldview染色10 min，觀測。將擴增后的DNA產(chǎn)物送至北京華大基因公司進行測序。測序結(jié)果利用NCBI中的BLAST軟件對測序結(jié)果進行序列同源性對比搜索。

1.2.4 拮抗活性內(nèi)生細菌的篩選

采用對峙培養(yǎng)法，將在PDA平板上活化培養(yǎng)5 d的病原菌，用直徑6 mm的無菌打孔器在菌絲生長外緣打取菌餅若干，放置于新的PDA平板中央，將從棗根部組織分離得到的內(nèi)生細菌點接在距離中央2.5 cm處的相對對角線上，每個平板點接4種內(nèi)生菌，每個處理重復2次，置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d后，觀察是否存在抑菌帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌的分離結(jié)果

分離操作中最后一次清洗的水涂布于 LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察，平板并未長出菌落，說明材料表面消毒完全。分離得到的內(nèi)生細菌根據(jù)形態(tài)差異進行平板劃線純化，最終獲得18個差異菌株，對其命名為Z1～Z18。

2.2 革蘭氏染色結(jié)果

將Z1～Z18進行革蘭氏染色，對其進行初步分類鑒定。革蘭氏染色顏色呈紫色為陽性菌，呈紅色為陰性菌，如圖1所示。

圖1 Z4號、Z12號菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

18株內(nèi)生細菌革蘭氏染色結(jié)果如表1，其中12個菌株為革蘭氏陰性菌，占鑒定總數(shù)的2/3，而革蘭氏陽性菌為6個菌株，為1/3；可以看出棗內(nèi)生細菌大部分為革蘭氏陰性菌，內(nèi)生菌中革蘭氏陽性菌和陰性菌的比例與前人研究結(jié)果一致[13]。

表1 革蘭氏染色結(jié)果

2.3 內(nèi)生細菌的16S rDNA序列及同源性分析

將提取出來的內(nèi)生細菌總DNA作為模板，使用細菌通用引物27 F/1 492 R擴增，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠上點樣電泳，均獲得了約1.5 kb的目的條帶（圖2～圖3），結(jié)果說明，成功擴增了內(nèi)生細菌的16S rRNA基因的DNA片段。

將內(nèi)生細菌的16S rRNA基因片段的PCR產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物連接載體的陽性克隆菌液送至華大基因公司測序，得到18個菌株的16S rRNA基因的DNA片段序列。

圖2 從左到右Z1～Z6號，Z7～Z10號菌PCR擴增的電泳結(jié)果

圖3 Z11～Z18號菌PCR擴增的電泳結(jié)果

利用NCBI中的BLAST軟件對測序結(jié)果進行序列同源性比對搜索，結(jié)果18個菌株均找到與其相似度最高的菌株（見表2），分屬于6個屬，分別為金黃桿菌屬（Chryseobacterium）1株、假單胞菌屬（Pseudomonas）5株、芽孢桿菌屬（Bacillus Cohn）6株、志賀氏菌屬（Shigella Castellani）1株、埃希氏菌屬（Escherichia coli）3株、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）2株。優(yōu)勢菌群是芽孢桿菌屬（Bacillus）。大部分棗樹的內(nèi)生細菌與NCBI存在序列的同源性超過97%。

表2 Z1～Z18內(nèi)生細菌鑒定結(jié)果

續(xù)表2

利用MEGA7.0對分離的內(nèi)生細菌的16S rRNA基因序列以及在 NCBI上比對同源性最高的序列進行序列比對，刪去前后未被匹配上的堿基，以鄰近相接法（Neighbor-joining法）對18株分離得到的內(nèi)生細菌以及與 NCBI中比對得到的同源性最高的序列進行聚類，采用1 000同源性最高的序列進行聚類，采用1 000個重復做Bootstrap檢驗，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

圖4 Z1～Z18與NCBI中同源性最高序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 拮抗內(nèi)生細菌篩選

對峙培養(yǎng)5 d后，棗黑點、棗輪紋、棗鏈格病原菌菌絲不斷擴展，Z1～Z17內(nèi)生細菌逐漸被包圍、覆蓋，即說明這些內(nèi)生細菌對上述3種病原菌無拮抗作用，如圖5。而Z18號菌對上述3種病原菌對峙培養(yǎng)顯示有著不同程度的拮抗作用，抑菌帶一直存在，且越來越明顯。其中，Z18號菌對棗輪紋病原菌的抑制作用最明顯，抑菌圈的直徑最大，而對棗黑點、棗鏈格病原菌的抑制作用相對較小，兩菌落逐漸靠近，但無覆蓋，見圖6。

圖5 某些內(nèi)生細菌對棗主要病原菌無拮抗作用

圖6 Z18號菌對三種病原菌的拮抗作用

3 結(jié)論與討論

通過對棗樹根部內(nèi)生細菌的分離與篩選，得到一株對棗黑點、棗輪紋、棗鏈格病原菌有拮抗作用的菌株Z18。利用傳統(tǒng)分類方法和 16S rRNA序列測定對菌株進行了鑒定，菌株Z18初步鑒定為芽孢桿菌，革蘭氏染色呈陽性。

芽孢桿菌抗逆性較強，是植物病害的生物防治中應用最廣泛的細菌。目前，芽孢桿菌用于林木抗病促生在國內(nèi)已有一定研究，如蔡麗等從鳳凰單叢茶分離篩選出具有抑菌活性的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，對梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌的菌絲具有較強的抑制作用[14]。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)主要包括脂肽類、聚酮類及抗菌蛋白等，芽孢桿菌易于在田間定值，也便于分離、培養(yǎng)以及保存；已有研究顯示芽孢桿菌已經(jīng)成功的在生產(chǎn)實踐中應用于生物防治[15]。劉偉成等[16]利用芽孢桿菌B08的菌懸液及滅菌后的發(fā)酵液經(jīng)過田間小區(qū)防治試驗顯示均具有較好的防病作用，對小麥赤霉病抑制效果明顯而持久。由此可見，篩選棗內(nèi)有益內(nèi)生菌并利用其開發(fā)對環(huán)境友好、高效、專一的生物農(nóng)藥，對克服化學防治的負面影響，保證棗高質(zhì)增產(chǎn)具有重要的意義。

本試驗表明了在棗根部存在可利用的內(nèi)生細菌，給生物防治棗類真菌性病害以及植原體病害的生物防治提供材料。由于拮抗菌株Z18是從棗根部組織分離得到，且所有的試驗均在實驗室完成，Z18號菌株在植物活體條件下對本試驗 3種病原菌的拮抗作用是否呈正相關(guān)，Z18的各種理化性質(zhì)以及拮抗機理尚不明確，本研究后續(xù)將進行拮抗菌回接活體植株的試驗，對生物防治棗黑點、棗輪紋、棗鏈格病原菌引起的棗類病害提供科學依據(jù)。