固定化混合菌修復(fù)凍融土壤PAHs污染的研究

普 聿，蘇 丹*，王 鑫，王天杰，劉 偉

（1.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，沈陽(yáng) 110036；2.沈陽(yáng)大學(xué)區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110044）

多環(huán)芳烴（PAHs）是一類具有復(fù)雜苯環(huán)結(jié)構(gòu)的高積累有毒化合物，是土壤中難降解的有機(jī)污染物。在我國(guó)，土壤的PAHs污染處于中低水平，PAHs的生物聚集、難降解性導(dǎo)致其長(zhǎng)時(shí)間積留在土壤的表層與亞表層中，土壤PAHs污染將是一個(gè)潛在的環(huán)境隱患。

固定化微生物技術(shù)是目前修復(fù)土壤PAHs污染的常用技術(shù)，該技術(shù)解決了微生物易受環(huán)境、溫度影響以及生物有效性低等問題，很大程度上提高了反應(yīng)的修復(fù)效果。目前土壤的PAHs污染修復(fù)主要基于常溫條件下的微生物修復(fù)，在秋冬長(zhǎng)期的凍融環(huán)境下，低溫抑制了微生物的生長(zhǎng)代謝，造成修復(fù)效果差[1]。已有大量研究表明嗜冷菌[2]和耐冷菌[3]均對(duì)凍融環(huán)境有較高的抗性，但在原位土壤修復(fù)中如何應(yīng)用這類菌株尚缺乏相關(guān)研究。Juhasza等[4]研究表明，高環(huán)PAHs的降解主要以共代謝的方式，真菌分泌的酶類物質(zhì)可分解高環(huán)PAHs的苯環(huán)，開環(huán)過(guò)程所產(chǎn)生的有毒中間物質(zhì)通常需要細(xì)菌的聯(lián)合作用才能將其礦化成水和CO2，真菌-細(xì)菌的聯(lián)合作用極大提高了PAHs降解的差異性。微生物降解過(guò)程中群落的多樣性與污染修復(fù)效率密切相關(guān)，能更清楚地揭示降解的機(jī)制，由于傳統(tǒng)的分子指紋圖譜通常一次分析低于100條微生物序列，對(duì)土壤中復(fù)雜的微生物分析性準(zhǔn)確度覆蓋率低[5]。高通量測(cè)序技術(shù)能一次對(duì)幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行測(cè)序分析，因而能更精準(zhǔn)地分析土壤中復(fù)雜微生物的群落變化。

本研究通過(guò)構(gòu)建玉米芯-耐低溫真菌-細(xì)菌共生體系，分析其在低溫環(huán)境下對(duì)PAHs污染土壤的生物強(qiáng)化修復(fù)效果；通過(guò)擬合PAHs的濃度變化，構(gòu)建動(dòng)力學(xué)方程，分析降解過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化與污染物濃度變化的相關(guān)關(guān)系，從PAHs降解動(dòng)力學(xué)與微生物多樣性角度揭示玉米芯-真菌-細(xì)菌共生體系對(duì)凍融環(huán)境的抗性機(jī)制，為寒冷地區(qū)的PAHs污染土壤修復(fù)提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為普及和推廣耐冷微生物修復(fù)環(huán)境污染提供一個(gè)全新的視角和方向。

1 材料與方法

1.1 供試材料

凍融土壤：2017年12月16日采自前北京焦化廠的表層凍融土（0～20 cm），其基本理化性質(zhì)：pH 8.36，總氮0.251%，總碳12.36%。

載體玉米芯購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，乙腈為色譜純（Sigma-Aldrich公司），正己烷和二氯甲烷均為分析純（山東禹王實(shí)業(yè)總公司），硅膠60～100 mm（國(guó)藥集團(tuán)有限公司）。

菌株：混合菌由本研究室前期分離篩選，經(jīng)菌株鑒定分別為假單胞菌（Pseudomonas sp.SDR4）和高山被孢霉菌（Mortierella alpina.JDR7）。

固定化增殖培養(yǎng)基（1.0 mL·g-1）：蔗糖4 g、酵母膏 0.3 g、KH2PO40.05 g、（NH4）HPO40.2 g、MgSO4·H2O 0.025 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固定化玉米芯混合菌的制備

將碾碎的玉米芯顆粒（1.0～1.5 cm）置于烘箱中120℃烘干，加入1.0%的生石灰溶液浸泡24 h，和麥麩（20%）混勻，控制含水率為47%，將pH調(diào)節(jié)為7.1，搖床振蕩 24 h（110 r·min-1），離心 15 min（3000 r·min-1）后棄上清液，烘干后過(guò)篩，在高壓蒸汽滅菌器（MLS-3780）121℃滅菌60 min。將假單胞菌和高山被孢霉菌至于完全培養(yǎng)基中，15℃、110 r·min-1搖床培養(yǎng)30～40 h，制得假單胞菌細(xì)菌密度為：6×108cfu·g-1、高山被孢霉菌孢子懸濁液密度為：6×108cfu·g-1。將假單胞菌與高山被孢霉菌接種于完全培養(yǎng)基中，15 ℃、110 r·min-1搖床混合培養(yǎng)3 d，制備復(fù)合菌劑（按體積比，假單胞菌∶高山被孢霉菌=1∶1）。用增殖培養(yǎng)基浸潤(rùn)滅菌后的玉米芯顆粒12 h，按10%量接種復(fù)合菌劑，放置于低溫光照培養(yǎng)箱（GZH-0328）在15℃溫度下適量的補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)7 d制得玉米芯固定化混合菌顆粒[6]。

1.2.2降解試驗(yàn)

模擬冬季土壤的凍融循環(huán)試驗(yàn)，將土樣分裝于培養(yǎng)瓶中，每瓶5 g，放置在XT5405型高低溫凍融循環(huán)試驗(yàn)箱避光低溫培養(yǎng)：在-10℃凍結(jié)2 d，10℃解凍2 d（降解總周期60 d，共凍融循環(huán)15次），試驗(yàn)設(shè)3組對(duì)照：（1）按土壤質(zhì)量的10%接種固定化混合菌，游離菌為對(duì)照，表征游離菌與固定化菌PAHs的降解效果差異；（2）滅菌土壤投加空白載體，表征因載體吸附導(dǎo)致的非生物性的污染物降解；（3）未滅菌土壤，表征土著菌的降解效果，及投加混合菌后是否會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)影響；（4）未滅菌土壤投加空白載體，表征固定化土著菌與固定化混合菌的降解效果差異。隨時(shí)補(bǔ)加無(wú)菌水保證土壤含水率為30%。分別在0、15、30、45、60 d時(shí)測(cè)定土壤中Phe、BbF的殘留量，計(jì)算各處理組的去除率（η）。

式中：W為初始土壤殘余PAHs含量，g；Wx為土壤中殘余PAHs含量，g。

每種處理設(shè)置3個(gè)平行，重復(fù)2次。實(shí)驗(yàn)分組如下：

CK為未滅菌土樣（CK）；CK1為滅菌土壤；CK2為滅菌土樣+滅菌玉米芯載體；H為未滅菌土樣+游離混合菌；MC-S4J7為未滅菌土樣+玉米芯固定化混合菌顆粒；MC-CK為未滅菌土樣+滅菌玉米芯載體。

1.2.3 土壤PAHs含量的提取和檢測(cè)

土壤中PAHs含量采用超聲提取HPLC法測(cè)定[7]。取土樣過(guò)篩加入15 mL二氯甲烷超聲2 h，濾膜過(guò)濾后加入10 mL二氯甲烷再次超聲1 h，經(jīng)硅膠柱凈化處理，氮?dú)獯蹈珊? mL乙腈定容，高效液相色譜儀（Agilent 1100型）測(cè)定，PAHs分析專用柱ZORBAX EclipsePAH，柱溫（25±0.1）℃，流動(dòng)相乙腈∶水=60%∶40%，流速 1.100 mL·min-1，進(jìn)樣量為 10 μL，各種PAHs以色譜峰保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量，方法回收率為82.16%～91.43%。

1.2.4 微生物多樣性

對(duì)原土樣（CK）和投加玉米芯固定化混合菌（MC-S4J7）修復(fù)30 d后的土樣進(jìn)行高通量測(cè)序分析。主要分析步驟如下：根據(jù)OMEGA E.Z.N.ATMMagBind SoilDNA Kit試劑盒提取土壤樣品的總DNA，利用Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量[8]。第一輪PCR擴(kuò)增：細(xì)菌（16S rDNA）已融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物，341F引物為：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，805R引物為：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’，真菌（ITS）已融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的ITS1-ITS2通用引物，ITS1F引物為：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，ITS2R引物為：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。引入Illumina橋式PCR兼容引物后，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增[9]。利用Prinseq軟件對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，將所測(cè)序列與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，使用Mothur軟件歸類同種可操作分類單元（OTU），計(jì)算多樣性指數(shù)，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行物種分類分析和菌種差異分析。數(shù)據(jù)分析、接頭、引物序列等去噪及OTU、Alpha和Beta多樣性等相關(guān)分析均由上海生工有限公司完成，各指數(shù)計(jì)算方法如下：

式中：Sobs為實(shí)際OTU；n1為只含1條OTU；n2為只含2條OTU；ni為第i個(gè)OTU包含序列數(shù)；N為總OTU數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤PAHs含量

土壤中PAHs含量見表1。

由表1可知，土壤的PAHs總量為（247.1±18.14）mg·kg-1，土壤中以三環(huán)和四環(huán)PAHs為主，其中菲Phe（3環(huán)）占總量的40.2%，含量最高，高環(huán)PAHs中含量最高的是BbF，為（6.12±1.1）mg·kg-1。本試驗(yàn)主要研究?jī)煞N含量較高且具有代表性的Phe、BbF的降解。

表1 焦化廠土壤中PAHs濃度Table 1 PAHs concentrations in coking plant soil

2.2 PAHs的非生物損失

Phe和BaP在土壤中不易揮發(fā)，較難降解，在低溫凍融環(huán)境下培養(yǎng)60 d后，僅添加空白載體CK2與滅菌土壤CK1相比，對(duì)Phe和BbF去除差異不大，分別為0～4% 和 0～3%。在 CK1中仍有（89.76±1.49）%和（94.71±0.99）%的Phe和BaP，表征揮發(fā)損失和載體吸附所造成的污染物非生物損失很小。

2.3 PAHs的生物修復(fù)

通過(guò)土壤中PAHs含量變化來(lái)反映修復(fù)效果，修復(fù)結(jié)果見圖1。

由圖1知，60 d后3種處理組降解率分別為：MCH＞H＞MC-CK＞CK。MC-S4J7的投加對(duì)凍融交替作用下的土壤修復(fù)效果顯著（P＜0.05），可分別降解（56.62±3.21）%和（38.21±1.82）%的Phe和BbF。玉米芯作為載體對(duì)微生物及酶都有很強(qiáng)的親和力，將混合菌吸附固定后，載體本身構(gòu)建的限定空間為菌體創(chuàng)造了緩沖的微環(huán)境，隔斷了菌體與惡劣土壤環(huán)境的直接接觸[10]；很大程度上降低了土著菌或噬菌體的惡性競(jìng)爭(zhēng)和侵害[11]，同時(shí)玉米芯的孔隙結(jié)構(gòu)會(huì)吸附、富集土壤中分布不均的PAHs，成為土著菌馴化的場(chǎng)所[12]；菌體分泌的胞外酶也會(huì)被固定，提高了有效降解菌的活性和單位細(xì)胞密度；玉米芯腐殖化過(guò)程中產(chǎn)生的各種溶解性有機(jī)質(zhì)可以促進(jìn)高環(huán)PAHs的共代謝作用[13]，因而提高了混合菌對(duì)Phe、BbF的降解作用。

處理組中Phe的降解率普遍高于BbF，這是因?yàn)槲⑸锝到庵饕抢盟苤械腜AHs，BbF的苯環(huán)數(shù)多，其正辛醇-水分配系數(shù)Kow值較大[14]，不易溶解，更易吸附在土壤有機(jī)質(zhì)中，導(dǎo)致固相向液相的遷移率低[15]，不易被菌株所利用，造成BbF的降解率低于Phe。

焦化土壤中存在的土著微生物對(duì)Phe和BbF有一定的降解作用，但由于溫度過(guò)低、有毒微生物的惡性競(jìng)爭(zhēng)及PAHs分布不均等問題，造成土著菌的降解酶活性低下，因此CK和MC-CK處理組的修復(fù)效果不顯著。

圖1 混合菌對(duì)土壤中Phe和BbF的降解率Figure 1 Degradation rates of Phe and BbF by immobilized strains in 60 days

游離混合菌的投加，在一定程度提高了土壤中Phe、BbF的去除率，但修復(fù)效果并不理想。研究指出大部分常溫微生物的最適生長(zhǎng)溫度在30℃以上[16]，在低溫環(huán)境下很難保持活性甚至處于休眠狀態(tài)，假單胞菌（Pseudomonas sp.SDR4）和高山被孢霉菌（Mortierella alpina.JDR7）均為高效的耐冷菌株，耐冷菌株的細(xì)胞膜中含有較高的短鏈脂肪酸[17]，可以提高細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換，此外分泌的同工酶也可以調(diào)節(jié)溫度的變化[18]，從而保持高的代謝活性，因此在0～5℃低溫下仍可生長(zhǎng)繁殖[19]。

2.4 PAHs降解速率及動(dòng)力學(xué)

2.4.1 PAHs降解速率

微生物通過(guò)分泌酶類物質(zhì)來(lái)降解PAHs，發(fā)生的酶促反應(yīng)符合Michaelis-Menton動(dòng)力學(xué)方程[20]，根據(jù)動(dòng)力學(xué)方程可計(jì)算出混合菌對(duì)Phe和BbF降解達(dá)到穩(wěn)定前期和穩(wěn)定期各個(gè)時(shí)段的降解速率v，見表2。

表2 混合菌對(duì)凍融土壤中Phe和BbF的降解速率（d-1）Table 2 Degradation rate per day of PAHs during specific presteady and quasi-staedy-steady by strains（d-1）

混合菌對(duì)土壤中的Phe和BbF降解速率在不同階段的動(dòng)態(tài)變化見圖2。

圖2 混合菌對(duì)土壤中Phe和BbF的降解動(dòng)態(tài)變化Figure 2 Dynamics of Phe and BbF in soils degrated by strains

由圖2可知，3種處理方式下的土壤均呈現(xiàn)出一致的降解規(guī)律，0～15 d為降解的高速階段，15～60 d降解進(jìn)入緩慢階段，趨于平緩。由Michaelis-Menton方程可知當(dāng)反應(yīng)到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)，降解速率與PAHs的濃度呈正相關(guān)。分析原因如下：降解試驗(yàn)的階段性時(shí)期的降解機(jī)制不同，穩(wěn)定前期（0～15 d）Phe和BbF的初始濃度較高，由物理、化學(xué)及生物3種降解機(jī)制共同作用，降解速率快，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，污染物濃度降低，生物降解成為主導(dǎo)作用，但生物降解的強(qiáng)度會(huì)隨著降解周期的延長(zhǎng)而減弱，導(dǎo)致速率下降；PAHs降解中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)上含有一定的羧基、環(huán)氧等親水基團(tuán)，代謝的中間產(chǎn)物會(huì)被微生物降解、同化吸收，同時(shí)中間產(chǎn)物易與土壤共價(jià)結(jié)合，造成與未降解的PAHs產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，降低PAHs的可提取態(tài)含量與生物可利用性，導(dǎo)致降解速率降低[21]；土壤的納米孔隙會(huì)吸附污染物，PAHs在孔隙中難被利用，易與降解菌產(chǎn)生隔斷，導(dǎo)致降解速率降低[22]。

由表2知，H處理組在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定期對(duì)Phe、BbF 降解速率分別為 1.490、0.208 d-1和 0.038、0.015 d-1，MC-H處理組降解速率明顯高于H處理組，降解速率分別為2.024、0.651 d-1和0.076、0.027 d-1，固定化處理后的混合菌，對(duì)PAHs降解速率明顯得到提高。

2.4.2 PAHs降解速率及動(dòng)力學(xué)

建立Monod模型，得到動(dòng)力學(xué)方程：

式中：c為PAHs濃度，mg·kg-1；t為反應(yīng)時(shí)間，d；k為動(dòng)力學(xué)常數(shù)。Phe和BbF降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)特征，結(jié)果見表3。

由表3可知，CK中Phe、BbF的半衰期分別為272.51、736.71 d，土壤中土著菌在低溫下幾乎不能生長(zhǎng)代謝，原土壤中對(duì)高環(huán)BbF的降解菌過(guò)少，從而導(dǎo)致半衰期過(guò)長(zhǎng)。經(jīng)固定化處理的混合菌縮短了凍融土壤中Phe、BbF降解的半衰期，分別縮短至50.167、82.12 d。鞏宗強(qiáng)等[23]研究指出一般降解微生物對(duì)Phe的自然降解半衰期為20 d，由于低溫凍融環(huán)境與微生物的代謝呈負(fù)相關(guān)，且凍融作用會(huì)造成土壤的有機(jī)碳增加，從而使PAHs易與土壤有機(jī)碳結(jié)合，極大降低了PAHs的降解速率，延長(zhǎng)降解半衰期[23]。

2.5 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析指標(biāo)是生態(tài)系統(tǒng)的群落多樣性綜合性指標(biāo)[24]，Ace和Chao 1指數(shù)越高，土壤群落豐富度越高，Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小則土壤群落多樣性越高[25]。

表3 動(dòng)力學(xué)方程Table 3 Dynamics equations

CK和MC-S4J7樣品中分別共獲得優(yōu)質(zhì)ITS序列、優(yōu)質(zhì)16S序列分別為109 728、160 298條，在97%相似性基礎(chǔ)上ITS和16S可劃分OTU分別為1207個(gè)和7105個(gè)。測(cè)序的覆蓋率指數(shù)為0.99和0.96，說(shuō)明本次測(cè)序可行性較高，覆蓋了焦化土壤中所有的真菌細(xì)菌類群。土樣Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果見表4。

由表4可知，MC-S4J7與CK的Alpha多樣性指數(shù)存在明顯差異，細(xì)菌群落豐富度和群落的均勻度降低，真菌的群落豐富度和群落均勻度提高；細(xì)菌的豐富度指數(shù)和Shannon指數(shù)為真菌的2～3倍，表征了焦化廠土壤土著微生物中以細(xì)菌為主。

表4 焦化廠土壤Alpha多樣性指數(shù)Table 4 Diversity index of soil Alpha in coking plant

分析原因如下：微生物對(duì)PAHs的降解主要通過(guò)降解和共代謝，焦化廠PAHs污染土壤中PAHs以三環(huán)和四環(huán)為主（約占90%，其中Phe含量最高），土壤中的土著微生物中以降解Phe的細(xì)菌居多。土樣中投加的玉米芯含有大量的纖維素，真菌是纖維素、木質(zhì)素等降解過(guò)程的主角，玉米芯的投加是處理后土樣真菌群落多樣性提高的主要原因。De Boer等[26]研究發(fā)現(xiàn)，土壤中的細(xì)菌誘發(fā)產(chǎn)生的抗生素會(huì)對(duì)真菌有一定抑制作用，高群落豐富度、均勻度的細(xì)菌會(huì)抑制真菌的生長(zhǎng)代謝。土樣修復(fù)30 d時(shí)，處于PAHs降解的穩(wěn)定期，PAHs降解速率趨于穩(wěn)定，此時(shí)土壤中存在大量的高效降解菌并成為優(yōu)勢(shì)菌株，造成細(xì)菌群落的豐富度和多樣性指數(shù)降低，細(xì)菌的群落多樣性降低極大減弱了對(duì)真菌的抑制作用，也一定程度上提高了真菌的群落多樣性。

2.6 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化

2.6.1 門水平群落結(jié)構(gòu)組成分析

分別對(duì)土樣的細(xì)菌和真菌前20和前11個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門進(jìn)行分析，門水平下土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)相對(duì)豐度如圖3、圖4所示。

由圖3可知，投加固定化混合菌生物強(qiáng)化修復(fù)30 d后，土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門發(fā)生了明顯的變化。土壤初期以放線菌門（Actinobacteria）為主，豐富度為86.71%，變形桿菌門（Proteobacteria）次之，豐富度為11.43%，還存在少量的硬壁菌門（Firmicutes），豐富度為0.68%。生物強(qiáng)化修復(fù)后變形桿菌門、硬壁菌門的豐富度均上升，變形桿菌門成為新的優(yōu)勢(shì)菌門，豐富度為88.72%。

由圖4可知，投加固定化混合菌生物強(qiáng)化修復(fù)30 d后，土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌門發(fā)生了明顯的變化，土壤中門水平下群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，土壤中真菌群落明顯增多。土壤初期以子囊菌門（Ascomycota）為主，豐富度為99.35%。生物強(qiáng)化修復(fù)后，鞭毛菌門（Mortierellomycota）成為新的優(yōu)勢(shì)菌門，豐富度為81.15%，子囊菌門（Ascomycota）豐富度降低至18.72%。

2.6.2 屬水平的群落結(jié)構(gòu)組成分析

屬水平下土壤的細(xì)菌（前33優(yōu)勢(shì)菌屬）和真菌（前20優(yōu)勢(shì)菌屬）屬水平下群落相對(duì)豐度如圖5、圖6所示。

由圖5可知，修復(fù)前，土壤中細(xì)菌相對(duì)豐度大于0.5%的優(yōu)勢(shì)菌屬有10個(gè)，分別是放線菌屬（Actinoalloteichus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、喬治菌屬（Georgenia）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、斯克曼菌屬（Skermanella）、雙球菌屬（Geminicoccus）、赤桿菌屬（Novosphingobium）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）和諾卡氏菌屬（Nocardioides），其豐富度分別為66.11%、6.26%、5.01%、2%、1.51%、0.92%、0.78%、0.62%、0.55%和0.54%。

投加固定化混合菌生物強(qiáng)化修復(fù)30 d后，細(xì)菌的菌屬多樣性降低，土壤中相對(duì)豐度大于0.34%菌屬的種類下降至9個(gè)。土壤中細(xì)菌假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對(duì)豐度由6.26%上升至80.03%成為新的優(yōu)勢(shì)屬，其他豐度較高的菌屬為：代爾夫特菌屬（Delftia），豐度為7.53%；芽孢桿菌屬（Bacillus），豐度為4.91%；喬治菌屬（Georgenia），豐度為0.02%。

由圖6可知，修復(fù)前，真菌主要由曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）構(gòu)成，其豐度分別為97.98%、0.31%。

投加固定化混合菌生物強(qiáng)化修復(fù)30 d后，真菌的菌屬多樣性略有增加。真菌被孢霉屬（Mortierella）成為顯著的優(yōu)勢(shì)菌屬，豐度上升至81.15%，地絲霉屬（Geomyces）次之，豐度為7.46%，曲霉屬（Aspergillus）豐度降低至6.72%，鐮刀菌屬（Fusarium）豐度提高至1.22%。

圖3 土壤細(xì)菌門水平相對(duì)豐度Figure 3 Relative abundance of the dominant phyla in different treatments（Bacteria）

圖4 土壤真菌門水平相對(duì)豐度Figure 4 Relative abundance of the dominant phyla in different treatments（Fungi）

圖5 土壤細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度Figure 5 Relative abundance of the dominant genera in different treatments（Bacteria）

圖6 土壤真菌屬水平相對(duì)豐度Figure 6 Relative abundance of the dominant genera in different treatments（Fungi）

生物強(qiáng)化修復(fù)土壤中，固定化混合菌的投加對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)造成了明顯變化，顯著降低了細(xì)菌的群落多樣性和均勻度。Tian等[27]指出，土壤中微生物群落多樣性變化是暫時(shí)的，到降解的末期時(shí)，土壤中PAHs濃度大幅度下降，降解速率逐漸緩慢，優(yōu)勢(shì)菌種的豐度會(huì)開始下降，直至與土壤中其他微生物達(dá)到一個(gè)平衡的狀態(tài)，微生物的群落結(jié)構(gòu)也會(huì)恢復(fù)到初期的穩(wěn)定狀態(tài)。玉米芯富集了土壤中分布不均的PAHs，同時(shí)為菌株提供了適宜的生存環(huán)境，保證菌株高效的存活率，土壤中的假單胞菌屬（Pseudomonas）與被孢霉菌屬（Mortierella）在降解過(guò)程中豐度均大于80%，結(jié)合降解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程，在穩(wěn)定期的降解中假單胞菌屬（Pseudomonas）、被孢霉屬（Mortierella）的生長(zhǎng)代謝是PAHs降解的主要原因，投加混合菌后，假單胞菌（Pseudomonas.sp SDR4）、高山被孢霉菌（Mortierella alpina.JDR7）的高豐度，即形成的真菌-細(xì)菌高效共生降解體系是PAHs降解率提高的主要原因。

3 結(jié)論

（1）玉米固定化真菌-細(xì)菌共生體系的構(gòu)建對(duì)低溫凍融環(huán)境有較好的抗性，顯著提高了PAHs的降解率，60 d后，可分別降解（56.62±3.21）%和（38.21±1.82）%的Phe和BbF。

（2）Michaelis-Menton動(dòng)力學(xué)方程分析顯示，玉米芯固定化技術(shù)顯著提升了PAHs降解啟動(dòng)速率，穩(wěn)定前期對(duì)Phe和BbF降解速率可分別達(dá)到2.02 d-1和0.076 d-1，約為游離菌降解速率的2倍。

（3）一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型分析得出，固定化混合菌可將低溫下Phe和BbF降解半衰期縮短至50.17 d和80.12 d，約為游離菌降解半衰期的0.41倍，Monod更清晰地分析了混合菌對(duì)低溫土壤PAHs降解的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

（4）投加玉米芯固定化混合菌生物強(qiáng)化修復(fù)改變了土壤微生物的結(jié)構(gòu)和豐富度，降低了土壤細(xì)菌的種群多樣性，細(xì)菌的Shannon多樣性指數(shù)下降至2.33，屬水平下假單胞菌（Pseudomouas sp.SDR4）和高山被孢霉菌（Mortierella alpina.JDR7）成為降解過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌株，降解率與SDR4和JDR7的豐度呈正相關(guān)，其相對(duì)豐度為80.03%和80.15%，形成了降解真菌-細(xì)菌共生優(yōu)勢(shì)菌株體系，明顯提高了低溫土壤中的PAHs污染的修復(fù)效果。