Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化瓜蔞中皂苷的提取工藝研究

洪國(guó)君，鄢海燕，鄒純才

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

瓜蔞為葫蘆科植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)或雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms.)的成熟果實(shí)，主要用于胸痹心痛等癥[1]。其所含的皂苷類成分具有寧心安神、益氣通脈、抗腫瘤、生津止渴、免疫調(diào)節(jié)等功效[2-4]。但對(duì)瓜蔞中皂苷的提取工藝優(yōu)化未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化瓜蔞中皂苷的提取工藝。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV2550型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；KQ250DE超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；AUW-220D型電子天平(日本島津公司)；GKC數(shù)顯控溫水浴鍋(上海波絡(luò)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；eidolph-LR4010/4011jf旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)海道爾夫公司)。

1.2 材料 瓜蔞皮(河北安國(guó)市御顏坊中藥材有限公司，批號(hào)：201612)；瓜蔞子(河北安國(guó)市御顏坊中藥材有限公司，批號(hào)：201612)；香蘭素(香草醛)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140821，純度≥99.5%)；齊墩果酸( 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150911，純度≥99.5%)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 瓜蔞中總皂苷的提取 等量稱取已烘干(在40℃烘箱中放置24 h)瓜蔞皮和瓜蔞子[2](5∶5， g/g)，在超聲波清洗機(jī)(200 W,40 kHz)中超聲提取之后進(jìn)行抽濾，合并抽濾液，再用旋蒸儀將濾液濃縮至黏稠狀,用60%乙醇定容至100 mL,再取其1 mL定容至10 mL。

2.1.2 含量測(cè)定方法 將“2.1.1”中溶液靜置1 h后，取0.3 mL樣品溶液，加入5%香草醛-冰乙酸0.1 mL，高氯酸0.6 mL，置60℃恒溫水浴中加熱10 min，取出再放入冰水浴中冷卻15 min，然后加入5 mL冰乙酸后，搖勻，靜置20 min，最后用UV在551 nm處測(cè)吸光度值[5]，觀察其化學(xué)成分含量變化。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將齊墩果酸對(duì)照品用15%甲醇定容，分別配置成濃度梯度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5倍的溶液，測(cè)其吸光度，并以齊墩果酸濃度(g/L)為橫坐標(biāo)x,吸光度值(A)為縱坐標(biāo)y，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 y=8.1442x-0.1377，r=0.9993。

2.1.4 方法學(xué)驗(yàn)證 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率的RSD值最大分別為3.15%、1.77%、2.76%、3.31%，RSD均小于5%，表明測(cè)定方法可靠。

2.2 單因素考察實(shí)驗(yàn) 單因素考察主要考察乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)，在通過(guò)前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以及相關(guān)文獻(xiàn)記載[6-7]，將乙醇濃度的考察條件定于40%、50%、60%、70%、80%；料液比(g/mL)考察條件定于1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16；提取時(shí)間考察條件定于20、30、40、50、60 min；提取溫度考察條件定于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃；提取次數(shù)考察定于1、2、3、4、5次。在各項(xiàng)考察條件中選出一個(gè)最優(yōu)條件作為后續(xù)的提取條件，并為最終的響應(yīng)面優(yōu)化條件提供依據(jù)。

2.2.1 乙醇濃度的單因素考察 取40℃干燥24 h的瓜蔞(皮∶子=5∶5，g/g)，分別選用40%、50%、60%、70%、80%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶12，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為40 min，提取次數(shù)為3次，合并濾液后回收溶劑得稠膏，用60%乙醇定容至100 mL，備用。按“2.1.2”中方法進(jìn)行含量測(cè)定。

由圖1可知，當(dāng)乙醇濃度高于60%后吸光度增長(zhǎng)有所下降，故暫定其合適提取乙醇濃度為60%。

2.2.2 料液比的單因素考察 取40℃干燥24 h的瓜蔞(皮∶子=5∶5，g/g)，在“2.2.1”的條件下，選用60%乙醇為提取溶劑，料液比分別為1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為40 min，提取次數(shù)為3次，合并濾液后回收溶劑得稠膏，用60%乙醇定容至100 mL，備用。按“2.1.2”中方法進(jìn)行含量測(cè)定。由圖2可知，料液比在達(dá)到1∶12時(shí)吸光度值趨于平穩(wěn)，故暫定1∶12為最佳料液比。

圖1 不同乙醇濃度的吸光值

圖2 不同料液比的吸光度值

2.2.3 提取時(shí)間的單因素考察 取40℃干燥24 h的瓜蔞(皮∶子=5∶5，g/g)，在“2.2.2”的條件下，選用60%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶12，提取溫度為40℃，提取時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min，提取次數(shù)為3次，合并濾液后回收溶劑得稠膏，用60%乙醇定容至100 mL，備用。按“2.1.2”中方法進(jìn)行含量測(cè)定。由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間高于40 min后，吸光度值基本趨于平緩，故可暫定最優(yōu)提取時(shí)間為40 min。

圖3 不同提取時(shí)間的吸光度值

2.2.4 提取溫度的單因素考察 取40℃干燥24 h的瓜蔞(皮∶子=5∶5，g/g)，在“2.2.3”的條件下，選用60%乙醇為提取溶劑，料液比為1:12，提取時(shí)間為40 min，提取溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，提取次數(shù)為3次，合并濾液后回收溶劑得稠膏，用60%乙醇定容至100 mL，備用。按“2.1.2”中方法進(jìn)行含量測(cè)定。由圖4可知，提取溫度在高于30℃之后對(duì)提取的影響并不大，故選擇剔除此條件。

圖4 不同提取溫度的吸光度值

2.2.5 提取次數(shù)的單因素考察 取40℃干燥24 h的瓜蔞(皮∶子=5∶5，g/g)，在“2.2.4”的條件下，選用60%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶12，提取時(shí)間為40 min，提取溫度40℃，提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5、6次，合并濾液后回收溶劑得稠膏，用60%乙醇定容至100 mL，備用。按“2.1.2”中方法進(jìn)行含量測(cè)定。由圖5可知，提取次數(shù)超過(guò)3次基本對(duì)吸光度值大小影響很小，故可暫定最優(yōu)提取次數(shù)為3次。根據(jù)上述結(jié)果可確定單因素考察的最優(yōu)條件為乙醇濃度60%，料液比1∶12，提取時(shí)間30 min，提取次數(shù)3次。

圖5 不同提取次數(shù)的吸光度值

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)[3-4]將單因素中獲得的最優(yōu)條件作為0條件代碼代入軟件Design-expert，選擇乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素，按響應(yīng)面優(yōu)化L29(34),四因素三水平共得出29組實(shí)驗(yàn)，在完成試驗(yàn)后將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入，用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)軟件Design-Expert分析所得數(shù)據(jù)。

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化軟件設(shè)計(jì)，共需完成29組試驗(yàn)。

2.3.2 數(shù)據(jù)分析 通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，在“2.1.2”的方法下檢測(cè)吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]計(jì)算其含量，方差分析結(jié)果如表1所示。

由表1可知，模型的F=9.72，P<0.001，表明試驗(yàn)所采用的二次多項(xiàng)式回歸方程模型是極顯著的，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。失擬項(xiàng)P=0.0574(P>0.05)，無(wú)顯著性差異，表明無(wú)失擬因素存在，能夠較好地反映各因素與響應(yīng)值間的實(shí)際關(guān)系。

表1 響應(yīng)面二次多項(xiàng)式回歸方程方差分析

來(lái)源平方和自由度均方FP模型0.11147.57×10-39.72<0.0001A0.0310.0338.26<0.0001B0.01510.01519.440.0006C0.01210.01214.90.0017D0.02810.02835.53<0.0001AB2.12×10-412.12×10-40.270.6103AC6.91×10-316.91×10-38.870.01AD1.29×10-411.29×10-40.170.6904BC3.61×10-413.61×10-40.460.5071BD8.56×10-518.56×10-50.110.7452CD4.41×10-614.41×10-65.66×10-30.9411A21.83×10-311.83×10-32.350.1474B23.86×10-313.86×10-34.960.0429C22.38×10-312.38×10-33.060.1023D20.01210.01214.820.0018殘差0.011147.79×10-4失擬項(xiàng)0.01100.115.50.0574純誤差7.39×10-440.017總和0.12 28

2.3.3 瓜蔞提取物醇沉工藝優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證 根據(jù)“2.3.2”瓜蔞提取物醇沉工藝響應(yīng)面分析結(jié)果，求得最佳條件為A(1) B(1) C(0) D(0)。即選擇提取乙醇濃度為70%，料液比為1∶14，提取時(shí)間為30 min，提取次數(shù)為3次。

按照上述工藝條件選用5個(gè)不同批次瓜蔞樣品進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，由驗(yàn)證結(jié)果可知，RSD為0.0759%，小于2%[9]，有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.4 結(jié)果 瓜蔞中皂苷類有效成分在醇提法中的最佳條件為乙醇濃度70%，料液比1∶14(g/mL)，提取時(shí)間30 min，提取次數(shù)3次，測(cè)得皂苷含量為1.818 mg/g。

3 討論

在測(cè)瓜蔞中皂苷的含量時(shí)要盡量保證在加入香草醛冰乙酸后靜置時(shí)間相同，避免因人為誤差導(dǎo)致的吸光度偏差。實(shí)驗(yàn)中在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，先進(jìn)行了較大梯度的條件考察，然后再進(jìn)行單因素考察，因此后期所得的數(shù)據(jù)結(jié)果彼此間會(huì)在較小的幅度下波動(dòng)，從而導(dǎo)致顯著性差異不夠大，但是實(shí)際所得的優(yōu)化條件結(jié)果較為準(zhǔn)確。

在本實(shí)驗(yàn)中用單因素考察和Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，從多個(gè)梯度的數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行考察，操作性較強(qiáng)，可信度較高，使瓜蔞的乙醇提取工藝得到有效的優(yōu)化與改進(jìn)，為今后進(jìn)一步對(duì)瓜蔞中醇提物的研究鋪下了基礎(chǔ)，對(duì)瓜蔞類藥物的深入研究有著較為重要的科研意義。