腐殖酸鈉復(fù)合吸附劑吸附玉米赤霉烯酮的篩選及效果

許 靜，齊德生

（1.河南省安陽市文峰區(qū)農(nóng)牧水利局，河南 安陽 455000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

聯(lián)合國糧農(nóng)組織調(diào)查顯示，每年全世界谷物大約有25%受到霉菌毒素污染[1]，已知全世界能產(chǎn)生霉菌毒素的霉菌有150種，產(chǎn)出200種霉菌毒素[2]，其中玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是污染飼料的主要霉菌毒素之一。Placinta等[3]對二十多個國家調(diào)查研究顯示，大部分國家的谷物和動物飼料都不同程度地受到ZEN的污染。Stob等[4]最早從長霉的玉米(Zea mays)中分離得到玉米赤霉烯酮，Jean將ZEN感染植物過程分為田間霉菌以及儲藏霉菌兩類。此后玉米赤霉烯酮的污染及危害就越來越引起人們的重視。2017年上半年，劉鳳芝等[5]對我國部分地區(qū)飼料和飼料原料的ZEN污染狀況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示在全部356份樣品中，ZEN檢出率高達(dá) 95%，ZEN 平均含量為 698.0 μg·kg-1。玉米赤霉烯酮是2, 4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物，非類固醇結(jié)構(gòu)，具有類雌激素樣性能，可與體內(nèi)雌激素受體相結(jié)合，產(chǎn)生雌激素效應(yīng)，造成生殖激素紊亂，引起流產(chǎn)、死胎等，同時還會導(dǎo)致肝腎功能損、免疫抑制等[6-8]。玉米赤霉烯酮(ZEN)能造成動物急慢性中毒，影響動物生長性能及造成生殖疾病等，對動物健康有嚴(yán)重的危害。廣泛分布于小麥(Triticum aestivum)等糧食作物、畜禽飼料和土壤中，玉米赤霉烯酮毒素能在畜產(chǎn)品中殘留，其危害和所造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失已是不容忽視的問題。所以，如何有效消除玉米赤霉烯酮毒素的危害是非常必要的研究課題。

霉菌毒素脫毒方法目前分為4種，分別是物理脫毒、營養(yǎng)脫毒、生物脫毒和化學(xué)脫毒[9-11]。在長久以來的研究中，用物理、生物、化學(xué)和營養(yǎng)的方法去除飼料中的霉菌毒素，存在很多不足，如生產(chǎn)加工困難，破壞飼料中的養(yǎng)分，原料不易獲得，去毒不徹底等。目前，生產(chǎn)上應(yīng)用比較普遍的是物理吸附法，但是存在吸附效果不好，去除毒素單一等缺點(diǎn)，ZEN去除問題并沒有得到很好解決。腐殖酸鈉是以風(fēng)化煤、泥炭和褐煤為原料經(jīng)特殊工藝加工制成的一種具有多種功能的大分子有機(jī)弱酸鈉鹽，其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，已知腐植酸分子中含有苯環(huán)、稠環(huán)和某些雜環(huán)(如吡咯、呋喃、吲哚等)，各芳香環(huán)之間有橋鍵相連，芳香環(huán)上有各種功能基團(tuán)，主要是羧基、酚基、羥基、甲氧基、醌基等[12]。腐殖酸鈉中腐植酸干基含量超過75%，是一種生產(chǎn)綠色乳肉蛋食品用的良好獸藥和飼料添加劑[13-15]。國內(nèi)外關(guān)于腐殖酸鈉吸附純品ZEN的基礎(chǔ)性試驗(yàn)研究報道極少。為此，研究腐殖酸鈉對ZEN的吸附效果，并分析不同反應(yīng)體系下對腐殖酸鈉去除ZEN的影響，以期為腐殖酸類霉菌毒素吸附劑的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

吸附劑：腐植酸鈉、沸石(Zeolite)、凹凸棒(Palygorskite)、高嶺土(kaolin)、膨潤土(Bentonite)、活性炭、麥飯石(Medical stone)、硅藻石(Biatomite)；β-葡聚糖(β-Glucan)。玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品含量大于99%，購自Sigma。高效液相色譜儀(Sinochrom ODS-BP)，美國安捷倫科技有限公司。恒溫水浴振蕩器、離心機(jī)；甲醇、乙腈，均為色譜純，購自Fisher scientific。磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸；去離子水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 最佳脫毒劑篩選及反應(yīng)體系條件的影響

2.1.1 腐殖酸鈉與不同吸附劑復(fù)合試驗(yàn)

將腐殖酸鈉與其他脫毒劑(沸石、凹凸棒、高嶺土、膨潤土、活性炭、硅藻石，β-葡聚糖)分別按1∶3、1∶1、3∶1這3個比例進(jìn)行復(fù)合，空白組不添加吸附劑，然后進(jìn)行去ZEN試驗(yàn)，每個處理3個重復(fù)，取平均值，篩選出復(fù)合之后效果最佳的吸附劑。

2.1.2 復(fù)合脫毒劑最佳比例篩選

分別將腐殖酸鈉與在2.1.1篩選出的最佳配合物設(shè)置不同比例，分別為6∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶6，空白組不添加吸附劑，進(jìn)行去除ZEN試驗(yàn)，每個處理3個重復(fù)，取平均值，篩選出最佳比例，配制成復(fù)合劑G(G代表最佳)，記錄數(shù)據(jù)。

2.1.3 反應(yīng)條件對復(fù)合物G吸附ZEN的影響

分別設(shè)置不同的吸附劑添加量(5、10、15、20、25 mg)、pH(2、5、7、8)、震蕩時間 (30、60、90、120 min)、溫度 (20、37、60 ℃)，其他試驗(yàn)條件一致，離心之后高效液相色譜法測定上清液中玉米赤霉烯酮含量，進(jìn)而計(jì)算吸附量和吸附率。

2.1.4 復(fù)合劑G等溫吸附試驗(yàn)

精確稱取20 mg復(fù)合劑G于離心管中，分別加入 0.5、2、3、4、5 和 6 μg·mL-1ZEN 標(biāo)準(zhǔn)溶液20 mL，在 pH 為 7 的條件下，37 ℃ 120 r·min-1的恒溫振蕩水浴鍋上振蕩反應(yīng)90 min。反應(yīng)結(jié)束后于5 000 r·min-1離心10 min，并收集上清液，HPLC法測定上清液中剩余ZEN的含量，分別計(jì)算脫毒量和脫毒率。以脫毒反應(yīng)體系中霉菌毒素的濃度為橫坐標(biāo)，脫毒量為縱坐標(biāo)，繪制等溫脫毒曲線。

2.1.5 復(fù)合劑G-ZEN解析試驗(yàn)

等溫脫毒試驗(yàn)結(jié)束后，傾去上清液，在初始濃度為1 μg·mL-1ZEN離心管中分別加入10 mL pH為7的磷酸緩沖液、三氯甲烷、人工模擬胃液和人工模擬腸液作解吸液，在37 ℃ 120 r·min-1的恒溫振蕩水浴鍋上振蕩處理30 min，然后離心測定ZEN含量，經(jīng)殘液校正后，計(jì)算解吸率。解吸過程重復(fù)3次，求累積解吸率。

2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

2.2.1 脫度量及脫毒率的計(jì)算

式中：Q為脫度量(μg·g-1)；Y為脫毒率(%)；V為溶液的體積(mL)；m為腐殖酸鈉的用量(mg)；CO為ZEN初始濃度(μg·g-1)，C分別為反應(yīng)后ZEN的濃度 (μg·g-1)。

2.2.2 ZEN含量的測定

樣品經(jīng)三氯甲烷萃取、濃縮、凈化后，ZEN含量經(jīng)熒光分光光度法測定[16]。

2.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPASS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，方差分析顯著者則進(jìn)行Duncan's法多重比較，結(jié)果用“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 腐殖酸鈉與其他脫毒劑復(fù)合結(jié)果

在統(tǒng)一試驗(yàn)條件下，腐殖酸鈉與其他脫毒劑在3種比例之下進(jìn)行復(fù)合之后，對ZEN去除效果如表1所列。

腐殖酸鈉與沸石、麥飯石、葡聚糖、高嶺土、膨潤土等吸附劑進(jìn)行復(fù)合，對ZEN去除效果較不理想，脫毒率在10%～64%，但是腐殖酸鈉與活性炭對ZEN的脫毒率高達(dá)97.3%，此時腐殖酸鈉與活性炭比例為1∶1(表1)。因此本研究選取腐殖酸鈉與活性炭進(jìn)行復(fù)合試驗(yàn)。

表1 腐殖酸鈉與其他脫毒劑復(fù)合結(jié)果Table 1 Results of a complex experiment between humic acid sodium and commonly used adsorbents

3.2 腐殖酸鈉與活性炭最佳比例篩選

由3.1 篩選出最佳脫毒劑組合，進(jìn)行不同比例的復(fù)合，研究不同比例的腐殖酸鈉與活性炭復(fù)合劑去除ZEN效果，結(jié)果如表2所列。結(jié)果顯示，在考察范圍內(nèi)，隨著腐殖酸鈉比例的降低，復(fù)合劑的脫毒效果先遞減，但當(dāng)腐殖酸鈉與活性炭比例為2∶1時，對ZEN的脫毒率高達(dá)99.62%，ZEN幾乎全部被去除，效果最好，所以選取腐殖酸鈉：活性炭=2∶1時為最佳脫毒比例。

表2 不同比例的腐殖酸鈉與活性炭復(fù)合去除ZEN的效果Table 2 Detoxification of ZEN by different proportions of sodium humic acid and an activated carbon compound

3.3 復(fù)合劑G體外試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 復(fù)合劑G添加量對吸附的影響

通過分別添加5、10、15 mg復(fù)合劑G，測定不同添加量對復(fù)合劑G吸附ZEN的影響，結(jié)果如表3所列。

表3 復(fù)合劑添加量對ZEN吸附的影響Table 3 Effects of the amount of compound adsorbent on the detoxification of ZEN

在考查脫毒劑量范圍內(nèi)，隨著復(fù)合劑的增加，復(fù)合劑對ZEN的脫毒作用隨之增強(qiáng)。但當(dāng)復(fù)合劑用量增加到15 mg時，復(fù)合劑對ZEN的脫毒量達(dá)到最大(652.87 μg·g-1)，繼續(xù)增加復(fù)合劑用量，復(fù)合劑對ZEN 的脫毒量從 652.87 μg·g-1下降到 648.03 μg·g-1(P＞0.05)；試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)復(fù)合劑添加量為15 mg時，復(fù)合劑對ZEN吸附效果達(dá)到最佳。

3.3.2 振蕩時間對復(fù)合劑G吸附ZEN影響

通過設(shè)定不同振動時間，測定不同振蕩時間對復(fù)合劑G吸附ZEN的影響，結(jié)果如表4所列。

表4 振蕩時間對去除ZEN的影響Table 4 Effects of interaction time on the detoxification of ZEN

吸附過程中處理時間對去除ZEN是有一定影響的。隨著處理時間的增加，復(fù)合劑對ZEN的脫毒率和脫毒量逐漸增加，但是當(dāng)?shù)?0 min時，復(fù)合劑對ZEN的脫毒率及脫毒量達(dá)到了一個動態(tài)平衡。此后繼續(xù)延長時間到120 min，復(fù)合劑對ZEN的脫毒率和脫毒量與60 min時差異不顯著(P＞0.05)。因此，本研究選取60 min為最佳脫毒時間。

3.3.3 pH對復(fù)合劑G吸附ZEN影響

通過設(shè)定不同的pH的反應(yīng)體系，測定不同pH對復(fù)合劑G吸附ZEN的影響，結(jié)果如表5所列。

表5 溶液pH對去除ZEN的影響Table 5 Effects of solution pH on the detoxification of ZEN

結(jié)果顯示，在pH 2 ～7范圍內(nèi)，隨著溶液pH的增加，復(fù)合劑對ZEN的脫毒作用逐漸增加；到pH為7時達(dá)到最大，繼續(xù)增加溶液pH值，將會導(dǎo)致脫毒量由 650.81 μg·g-1降到 599.16 μg·g-1。由于復(fù)合劑是由無機(jī)物與有機(jī)物組成，其物化特性較為特殊，導(dǎo)致此類現(xiàn)象發(fā)生。說明了pH是影響脫毒劑去除ZEN的重要因素。

3.3.4 溫度對復(fù)合劑G吸附ZEN影響

一般來說，低溫有利于物理吸附，高溫有利于化學(xué)吸附。溫度對玉米赤霉烯酮毒素吸附的影響復(fù)雜，溫度升高，腐殖酸鈉分子熱運(yùn)動一般加快，此時大部分腐殖酸鈉溶解度也會增加，不利于物理吸附。當(dāng)溫度為20、37、60 ℃時，復(fù)合劑對ZEN 的吸附量分別為 283.12、651.64、386.29 μg·g-1，差異顯著(P＜0.05)，且與溫度變化不呈線性關(guān)系(表6)，說明復(fù)合劑G對ZEN的吸附既有物理吸附，也存在化學(xué)吸附。

表6 處理溫度對去除ZEN的影響Table 6 Effects of interaction temperature on the detoxification of ZEN

3.3.5 復(fù)合劑G等溫吸附試驗(yàn)

在37 ℃恒溫、pH 7、處理時間為60 min條件下，考察玉米赤霉烯酮初始濃度與脫毒效果間的關(guān)系。以脫毒反應(yīng)體系中ZEN濃度為橫坐標(biāo)，脫毒量為縱坐標(biāo)，得到復(fù)合劑對ZEN的等溫脫毒曲線。復(fù)合劑對ZEN的脫毒量隨著ZEN濃度的增大而逐漸增加，并且在考察濃度范圍內(nèi)，復(fù)合劑對ZEN 的最大毒量高達(dá) 961.42 μg·g-1(表7)。

表7 ZEN初始濃度對去除ZEN影響Table 7 Effects of initial concentration of ZEN on the detoxification of ZEN

3.3.6 復(fù)合劑G-ZEN復(fù)合物解析試驗(yàn)

三氯甲烷、PBS、人工模擬胃液、人工模擬腸液對ZEN-復(fù)合劑中ZEN的解吸率分別為3.17%、4.39%、6.39%和5.06%，都在20%以下(表8)，表明ZEN8在這些復(fù)合物中的穩(wěn)定性較高，同樣意味著它們對ZEN可能存在化學(xué)吸附。

表8 復(fù)合劑-ZEN復(fù)合物的穩(wěn)定性Table 8 Stability of the compound adsorbent-ZEN complex

3.3.7 復(fù)合劑G等溫試驗(yàn)結(jié)果擬合Langmuir與Freundlich方程

由回歸方程的擬合度系數(shù)(表9)看，復(fù)合劑對ZEN的等溫吸附既符合Langmuir方程，也符合Freundlich方程，但Freundlich方程的擬合程度(R2=0.973 9)大于 Langmuir方程的 (R2=0.961 8)。

4 討論

4.1 3種吸附劑效果評價

本研究中，在體外統(tǒng)一試驗(yàn)條件下，腐殖酸鈉與活性炭比例為2∶1復(fù)合成復(fù)合劑G時，對ZEN脫毒效果達(dá)到95.62%，而單獨(dú)使用腐殖酸鈉與活性炭的脫毒率分別為78.5%和69.17%。這3種吸附劑對ZEN吸附效果排序?yàn)椋簭?fù)合劑G＞腐殖酸鈉＞活性炭。復(fù)合劑G對ZEN的吸附在60 min達(dá)到一個吸附平衡，而腐殖酸鈉需用90 min才達(dá)到平衡，說明復(fù)合劑G能更快地吸附ZEN。

表9 Langmuir與Freundlich回歸方程Table 9 Regression equation of Langmuir and Freundlich isothermal

4.2 處理因素對吸附ZEN效果影響

4.2.1 溶液pH

有報道指出，霉菌毒素脫毒劑去除霉菌毒素效果，取決于脫毒劑的物質(zhì)結(jié)構(gòu)特性以及霉菌毒素的物理和化學(xué)性質(zhì)[17]。當(dāng)溶液pH值較低時，由于此時溶液中存在大量的H+，腐殖酸鈉表面的作用位點(diǎn)被H+大量占據(jù)，這就減少了腐殖酸鈉與ZEN的作用位點(diǎn)；同時，H+和ZEN的競爭效應(yīng)，H+能與腐殖酸鈉表面的不飽和離子發(fā)生離子交換作用，使得對ZEN吸附效果差。已知ZEN分子中含有2個酚氫基，等電點(diǎn)為7.16[18]，在溶液pH＜7.16時，ZEN主要呈弱酸性，所以當(dāng)pH=2、5時復(fù)合劑G對ZEN的脫毒作用較弱，此時復(fù)合劑G可能以物理方式吸附ZEN。隨著pH的增加，溶液中H+減少，與復(fù)合劑G競爭作用減弱，同時腐殖酸鈉中酚羥基等活性基團(tuán)的H+解離，使得復(fù)合劑G對ZEN的吸附能力增強(qiáng)。

4.2.2 試驗(yàn)溫度

本研究中，吸附劑在20 ℃和37 ℃條件下，37 ℃和60 ℃條件下的吸附情況不一致。這反映出腐殖酸鈉與復(fù)合劑G在低溫下好。在37 ℃時，復(fù)合劑G吸附率達(dá)99%。在高于常溫37 ℃時，腐殖酸鈉吸附較差，原因極可能是吸附是以物理吸附為主。但是在高溫時，復(fù)合劑G吸附率雖然吸附率有所下降，但是也達(dá)到了75.26%，說明復(fù)合劑G極也可能存在化學(xué)吸附，之所以吸附率會有所下降是原因可能是該化學(xué)反應(yīng)是放熱反應(yīng)。

4.2.3 脫毒劑用量

本研究中，在一定范圍內(nèi)，隨著腐殖酸鈉和復(fù)合劑G用量的增加，腐殖酸鈉及復(fù)合劑G對溶液中ZEN的脫毒作用逐漸增強(qiáng)，這與前人[19-21]關(guān)于霉菌毒素脫毒劑對霉菌毒素脫毒效果的影響結(jié)果一致。原因可能是吸附劑的添加量影響復(fù)合劑G與ZEN的有效作用位點(diǎn)結(jié)合。本研究結(jié)果顯示，復(fù)合劑G添加劑量要少于腐殖酸鈉的添加量，復(fù)合劑G更節(jié)省經(jīng)濟(jì)。

4.2.4 吸附穩(wěn)定的時間

本研究中，腐殖酸鈉吸附穩(wěn)定的時間為90 min，而復(fù)合劑G吸附穩(wěn)定的時間為60 min，此時達(dá)到了一個動態(tài)脫毒平衡。復(fù)合劑相對于單一吸附劑可以更快地達(dá)到吸附穩(wěn)定。吸附平衡的時間越短，在動物體內(nèi)吸附劑對ZEN的吸附作用越好，若吸附時間過長，吸附劑可能不會充分吸附飼料中的ZEN。

4.3 復(fù)合劑G對ZEN的吸附效果

在本研究體外試驗(yàn)中，添加1.5 mg·mL-1的復(fù)合劑G振蕩60 min后檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)復(fù)合劑G對ZEN吸附量隨著ZEN初始濃度增加而增加，考察范圍內(nèi)最高可達(dá)961.42 μg·g-1，這與前人[22]考察影響結(jié)果一致。

5 小結(jié)

在統(tǒng)一試驗(yàn)條件下腐殖酸鈉、活性炭、復(fù)合劑G對ZEN脫毒率分別為78.5%、69.17%、95.62%，復(fù)合劑G對ZEN的吸附效果最佳，并經(jīng)解析試驗(yàn)證明，復(fù)合劑G對ZEN吸附最為穩(wěn)定。本研究結(jié)果為腐殖酸類ZEN吸附劑的實(shí)際應(yīng)用提供了重要依據(jù)。