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    新疆苜蓿新病毒(BLRV)的鑒定

    2019-10-22 02:28:18李克梅阿孜古麗木漢買提葛瑞云劉學(xué)學(xué)李寶義熱甫卡提雪合拉提
    草業(yè)科學(xué) 2019年9期
    關(guān)鍵詞:卷葉花葉病毒菜豆

    李克梅,阿孜古麗·木漢買提,葛瑞云,劉學(xué)學(xué),李寶義,熱甫卡提·雪合拉提

    (新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

    苜蓿(Medicagospp.)素有“牧草之王”美譽(yù),具有適應(yīng)性強(qiáng),產(chǎn)草量高,富含蛋白質(zhì)等特性,作為牧草在世界范圍被廣泛種植[1],也可作為綠肥,改土肥田、保持水土、改善生態(tài)環(huán)境等[2]。目前全世界的苜蓿種植面積為3 300萬hm2,其中美國[3]約1 000萬hm2,我國[4]苜蓿約470萬hm2。我國苜蓿主產(chǎn)區(qū)為東北、華北和西北地區(qū)[5]。

    隨著苜蓿種植面積的逐步增加,苜蓿病毒病的發(fā)生狀況呈加重趨勢(shì),越來越多的病毒種類被發(fā)現(xiàn),病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象普遍存在,引起的癥狀類型越來越多樣化,嚴(yán)重影響苜蓿生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展[6]。苜蓿病毒病常表現(xiàn)為花葉、矮化或畸形等癥狀,使之產(chǎn)量降低,難以越冬[7]。國內(nèi)外研究報(bào)道,有多種病毒可以侵染苜蓿[8],在阿根廷紫花苜蓿田中發(fā)現(xiàn)有菜豆卷葉病毒(bean leafroll virus, BLRV)的侵染[9];在澳大利亞苜蓿田中發(fā)現(xiàn)有苜蓿矮化病毒(alfalfa dwarf virus, ADV)和苜蓿卷葉病毒(alfalfa leafroll virus, ALRV)的侵染[10];在沙特阿拉伯紫花苜蓿、雜草和栽培植物中檢測到苜?;ㄈ~病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)以及菜豆卷葉病毒[11];在伊朗苜蓿田中檢測到有苜?;ㄈ~病毒、菜豆卷葉病毒、花生矮化病毒(peanut stunt virus, PSV)和菜豆黃花葉病毒(bean yellow mosaic virus, BYMV) 4種病毒可以侵染苜蓿,檢出率分別為23.3%、12%、0.7%和0.28%[12];在甘肅張掖地區(qū)番茄花葉病毒(tomato mosaic virus, ToMV)和苜蓿花葉病毒復(fù)合侵染苜蓿[13];在新疆有菜豆黃花葉病毒和苜?;ㄈ~病毒侵染苜蓿的報(bào)道[14-15]。新疆是我國苜蓿種植的主要產(chǎn)區(qū)之一[16],近年來,牧草病害課題組成員在新疆苜蓿田間發(fā)現(xiàn)大量矮化、叢枝、卷葉等癥狀的植株,發(fā)病率為20%~100%,該病害不僅引起牧草大幅度減產(chǎn),而且極大地縮短苜蓿草地使用年限。2017-2018年,借助Si-RNA高通量測序分析,認(rèn)為在此類癥狀病株中可能攜帶有菜豆卷葉病毒。因此,本研究對(duì)栽培苜蓿疑似卷葉、矮化等癥狀的病害種類的病原開展BLRV分子檢測,以明確新疆苜蓿卷葉的癥狀是否由BLRV侵染引起,從而正確認(rèn)識(shí)該病害的病原種類以及分類地位,以便對(duì)該病害的防治提供理論依據(jù)[17]。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    待測苜蓿樣品的采集:2017年5月至2018年9月,分別在新疆北疆昌吉州的呼圖壁縣,烏魯木齊市的烏拉泊、板房溝、南山以及阿勒泰地區(qū)的布爾津、北屯、富蘊(yùn)縣采集表現(xiàn)為有卷葉、皺縮、矮化等癥狀的苜蓿病株樣品,同時(shí)將采集到的健康苜蓿植株作為陰性對(duì)照,每種癥狀的病葉樣品采集兩份,一份放入4 ℃短期保存,另一份樣品保存于-80 ℃冰箱,用于RNA提取等后續(xù)試驗(yàn)。

    菌株和質(zhì)粒:Transl-T1感受態(tài)細(xì)胞,pEASYT1克隆載體均采購于北京全式金生物技術(shù)有限公司,由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)病理研究室保存。

    生化試劑:10×PCR Buffer (Mg2+)、dNTPs(2.5 mmol·L-1)、Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1)、2 k bp DNA Marker、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)、cDNA第一鏈合成試劑盒、TRNzol Universal總RNA提取試劑、氨芐青霉素(Amp+)、X-gal、IPTG等生化試劑皆購于北京全式金生化生物科技有限公司;其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 苜蓿菜豆卷葉病毒的分子檢測

    1.2.1 苜蓿總RNA的提取

    分別稱取0.1~0.2 g的苜蓿病樣和健康植株樣品的嫩葉,用TRNZOL universal (全式金)試劑法提取苜蓿葉片的總RNA (提取方法參見產(chǎn)品操作說明書),并將提取的RNA置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 菜豆卷葉病毒的RPCR擴(kuò)增及電泳檢測

    將Trucco等[9]設(shè)計(jì)的BLRV的外殼蛋白基因特異性引物序列BLRV-F/BLRV-R提交至上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下:BLRV-F:5’-TAGGTTCCTTCGATTACAAG-3’,BLRV-R:5’-CTTCAATATTCGTCCAGTTC-3’。用全式金cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈,步驟按說明書進(jìn)行,將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩R院铣傻腸DNA第一鏈為模板,BLRV-F/BLRV-R為引物進(jìn)行常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增。在25 μL的RT-PCR反應(yīng)體系中,cDNA模板1 μL;Taq DNA聚合酶 0.5 μL;10×PCR Buffer 2.5 μL (2.5 mmol·L-1MgCl2); dNT Ps 1 μL (10 mmol·L-1);上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL;ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序:94 ℃4 min,94 ℃ 45 s,51 ℃ 45 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次;最后72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物,使用凝膠成像系統(tǒng)拍攝并記錄。

    1.3 序列測定及分析

    經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,切取特異性目的條帶,采用快速凝膠回收純化試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)回收、純化后,再與載體Trans1-T1(TRANS)在常溫下連接25 min,繼而進(jìn)行轉(zhuǎn)化、涂板、藍(lán)白斑篩選,將篩選到的含正確插入片段的質(zhì)粒送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測定。運(yùn)用DNAMAN8.0軟件將測序獲得的序列與GenBank中已提交的菜豆卷葉病毒代表性序列進(jìn)行核苷酸序列同源性對(duì)比分析,使用MEGA7.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,最終將獲得的序列提交至Bankit獲得序列登錄號(hào)(MK263743.1)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病株癥狀

    栽培苜蓿通常第1年不表現(xiàn)癥狀,第2年春季返青后即可表現(xiàn)癥狀,相對(duì)于健康苜蓿植株,疑似病毒病的苜蓿植株矮小,枝條細(xì)弱,葉片邊緣呈皺縮或有波紋的卷曲狀,常伴有花葉或黃化斑駁,發(fā)病嚴(yán)重的甚至無法開花(圖1)。

    圖1 苜蓿卷葉病毒病田間癥狀Figure 1 Symptoms of alfalfa leafroll virus disease in the field

    2.2 RT-PCR檢測

    對(duì)苜蓿病株樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測,用引物BLRV-F/BLRV-R可以擴(kuò)增出大小約為1 000 bp的特異性條帶(圖2)。

    圖2 BLRV RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 2 RT-PCR amplification of bean leafroll virus(BLRV)

    2.3 BLRV外殼基因片段序列測定及分析

    提取采集的疑似卷葉病毒病的苜蓿樣品總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物回收純化、克隆和序列測定。測序結(jié)果表明:從新疆苜蓿疑似感染BLRV的樣品中得到長955 bp的特異性片段,G+C含量為49.7%。經(jīng)序列比對(duì),所得核苷酸序列與已報(bào)道的豆科植物上菜豆卷葉病毒(BLRV)分離物核苷酸序列同源性介于85.1%~96.5%。其中與阿根廷苜蓿BLRV分離物(KR261610.1)、美國豌豆BLRV分離物(HM439776.1)和(GQ404380.1)、澳大利亞苜蓿BLRV分離物(MF075256.1)序列同源性分別為96.5%、93.0%、92.7.%和89.2% (表1)。

    2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和分析

    運(yùn)用MEGA7.0軟件中鄰接法將新疆苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)外殼蛋白基因序列與GenBank中已報(bào)道的相同基因部分序列以及苜?;ㄈ~病毒[18](MF075254.1)、苜蓿矮化病毒[10](FJ15933.1)、苜蓿卷葉病毒[22](KX574859)外殼蛋白基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。經(jīng)序列比較分析,從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可見(圖3),新疆侵染苜蓿的菜豆卷葉病毒BLRV-XJ分離物(MK263743)與希臘菜豆卷葉病毒(KT382814.1、HE601635.1、KT382812.1)分離物進(jìn)化樹關(guān)系最近,在同一進(jìn)化分支上,故將其鑒定為菜豆卷葉病毒(bean leafroll virus),同屬于黃癥病毒科(Luteoviridae)黃癥病毒屬(Luteovirus)。

    表1 新疆BLRV分離物外殼蛋白基因核苷酸序列與已報(bào)道BLRV分離物同源性比較Table 1 Comparison of the homology between the nucleotide sequence of the coat protein gene of bean leafroll virus (BLRV) isolates in Xinjiang and the reported BLRV isolates

    圖3 用鄰接法構(gòu)建的新疆菜豆卷葉病毒紫花苜蓿分離物外殼蛋白基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on the coat protein gene of the bean leafroll virus (BLRV)isolates on alfalfa in Xinjiang

    3 討論與結(jié)論

    截至2015年,我國苜蓿種植面積達(dá)到470.8萬hm2[23]。新疆是我國苜蓿種植的主要產(chǎn)地之一,近幾年苜蓿病毒病的發(fā)生越發(fā)嚴(yán)重,但病原報(bào)道不多。本研究利用菜豆卷葉病毒(BLRV)特異性引物對(duì)新疆苜蓿疑似病毒病植株進(jìn)行PCR檢測,擴(kuò)增出長955 bp特異條帶,測序序列比對(duì)結(jié)果與菜豆卷葉病毒(BLRV)同源性較高,與Trucco等[9]報(bào)道的阿根廷侵染苜蓿的BLRV(KR261610.)同源性最高。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知,新疆侵染苜蓿的菜豆卷葉病毒BLRV(MK263743)與已知豆科植物中的菜豆卷葉病毒聚為一類。該結(jié)果證明了新疆栽培苜蓿疑似卷葉病毒病的病原為菜豆卷葉病毒(BLRV)。阿根廷、伊朗、澳大利亞曾報(bào)道菜豆卷葉病毒侵染苜蓿[9,12,18],本研究結(jié)果首次證實(shí)該病毒在中國侵染苜蓿,豐富了苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)在中國新疆地區(qū)基因組序列信息,對(duì)今后的檢測提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

    目前,國內(nèi)苜蓿種子供應(yīng)量還有所不足,苜蓿干草也是我國進(jìn)口草產(chǎn)品中的主打產(chǎn)品[24]。苜蓿種子和干草常常是病原的直接傳播來源,我國苜蓿種子進(jìn)口國家有美國、澳大利亞、西班牙和加拿大等[25]。文朝慧等[26]利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析結(jié)合RT-PCR方法從52份紫花苜蓿種子樣品中檢測到45份攜帶有苜?;ㄈ~病毒(AMV)、3份攜帶菜豆黃花葉病毒(BYMV)。苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)很可能隨著進(jìn)口苜蓿種子和苜蓿干草的引進(jìn)傳入我國并引起危害,相關(guān)部門應(yīng)引起足夠重視。

    病毒是一類傳染性很強(qiáng)的植物病原生物,通過對(duì)病毒病的檢測,可及早發(fā)現(xiàn)感病植物體內(nèi)病毒的存在,對(duì)病害的防治以及深入研究病毒的病理特點(diǎn)具有重要的意義。目前我國對(duì)苜蓿病毒病的研究較少,在今后的工作中還需要進(jìn)一步開展檢測和防治技術(shù)研究。苜蓿病毒病對(duì)我國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在較大的威脅,確認(rèn)不同病毒之間的聯(lián)系以及病毒復(fù)合侵染問題還需要進(jìn)一步研究,為苜蓿病毒病害檢測及其防治奠定基礎(chǔ)。

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