• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    新疆苜蓿新病毒(BLRV)的鑒定

    2019-10-22 02:28:18李克梅阿孜古麗木漢買提葛瑞云劉學(xué)學(xué)李寶義熱甫卡提雪合拉提
    草業(yè)科學(xué) 2019年9期
    關(guān)鍵詞:卷葉花葉病毒菜豆

    李克梅,阿孜古麗·木漢買提,葛瑞云,劉學(xué)學(xué),李寶義,熱甫卡提·雪合拉提

    (新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

    苜蓿(Medicagospp.)素有“牧草之王”美譽(yù),具有適應(yīng)性強(qiáng),產(chǎn)草量高,富含蛋白質(zhì)等特性,作為牧草在世界范圍被廣泛種植[1],也可作為綠肥,改土肥田、保持水土、改善生態(tài)環(huán)境等[2]。目前全世界的苜蓿種植面積為3 300萬hm2,其中美國[3]約1 000萬hm2,我國[4]苜蓿約470萬hm2。我國苜蓿主產(chǎn)區(qū)為東北、華北和西北地區(qū)[5]。

    隨著苜蓿種植面積的逐步增加,苜蓿病毒病的發(fā)生狀況呈加重趨勢(shì),越來越多的病毒種類被發(fā)現(xiàn),病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象普遍存在,引起的癥狀類型越來越多樣化,嚴(yán)重影響苜蓿生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展[6]。苜蓿病毒病常表現(xiàn)為花葉、矮化或畸形等癥狀,使之產(chǎn)量降低,難以越冬[7]。國內(nèi)外研究報(bào)道,有多種病毒可以侵染苜蓿[8],在阿根廷紫花苜蓿田中發(fā)現(xiàn)有菜豆卷葉病毒(bean leafroll virus, BLRV)的侵染[9];在澳大利亞苜蓿田中發(fā)現(xiàn)有苜蓿矮化病毒(alfalfa dwarf virus, ADV)和苜蓿卷葉病毒(alfalfa leafroll virus, ALRV)的侵染[10];在沙特阿拉伯紫花苜蓿、雜草和栽培植物中檢測到苜?;ㄈ~病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)以及菜豆卷葉病毒[11];在伊朗苜蓿田中檢測到有苜?;ㄈ~病毒、菜豆卷葉病毒、花生矮化病毒(peanut stunt virus, PSV)和菜豆黃花葉病毒(bean yellow mosaic virus, BYMV) 4種病毒可以侵染苜蓿,檢出率分別為23.3%、12%、0.7%和0.28%[12];在甘肅張掖地區(qū)番茄花葉病毒(tomato mosaic virus, ToMV)和苜蓿花葉病毒復(fù)合侵染苜蓿[13];在新疆有菜豆黃花葉病毒和苜?;ㄈ~病毒侵染苜蓿的報(bào)道[14-15]。新疆是我國苜蓿種植的主要產(chǎn)區(qū)之一[16],近年來,牧草病害課題組成員在新疆苜蓿田間發(fā)現(xiàn)大量矮化、叢枝、卷葉等癥狀的植株,發(fā)病率為20%~100%,該病害不僅引起牧草大幅度減產(chǎn),而且極大地縮短苜蓿草地使用年限。2017-2018年,借助Si-RNA高通量測序分析,認(rèn)為在此類癥狀病株中可能攜帶有菜豆卷葉病毒。因此,本研究對(duì)栽培苜蓿疑似卷葉、矮化等癥狀的病害種類的病原開展BLRV分子檢測,以明確新疆苜蓿卷葉的癥狀是否由BLRV侵染引起,從而正確認(rèn)識(shí)該病害的病原種類以及分類地位,以便對(duì)該病害的防治提供理論依據(jù)[17]。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    待測苜蓿樣品的采集:2017年5月至2018年9月,分別在新疆北疆昌吉州的呼圖壁縣,烏魯木齊市的烏拉泊、板房溝、南山以及阿勒泰地區(qū)的布爾津、北屯、富蘊(yùn)縣采集表現(xiàn)為有卷葉、皺縮、矮化等癥狀的苜蓿病株樣品,同時(shí)將采集到的健康苜蓿植株作為陰性對(duì)照,每種癥狀的病葉樣品采集兩份,一份放入4 ℃短期保存,另一份樣品保存于-80 ℃冰箱,用于RNA提取等后續(xù)試驗(yàn)。

    菌株和質(zhì)粒:Transl-T1感受態(tài)細(xì)胞,pEASYT1克隆載體均采購于北京全式金生物技術(shù)有限公司,由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)病理研究室保存。

    生化試劑:10×PCR Buffer (Mg2+)、dNTPs(2.5 mmol·L-1)、Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1)、2 k bp DNA Marker、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)、cDNA第一鏈合成試劑盒、TRNzol Universal總RNA提取試劑、氨芐青霉素(Amp+)、X-gal、IPTG等生化試劑皆購于北京全式金生化生物科技有限公司;其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 苜蓿菜豆卷葉病毒的分子檢測

    1.2.1 苜蓿總RNA的提取

    分別稱取0.1~0.2 g的苜蓿病樣和健康植株樣品的嫩葉,用TRNZOL universal (全式金)試劑法提取苜蓿葉片的總RNA (提取方法參見產(chǎn)品操作說明書),并將提取的RNA置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 菜豆卷葉病毒的RPCR擴(kuò)增及電泳檢測

    將Trucco等[9]設(shè)計(jì)的BLRV的外殼蛋白基因特異性引物序列BLRV-F/BLRV-R提交至上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下:BLRV-F:5’-TAGGTTCCTTCGATTACAAG-3’,BLRV-R:5’-CTTCAATATTCGTCCAGTTC-3’。用全式金cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈,步驟按說明書進(jìn)行,將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩R院铣傻腸DNA第一鏈為模板,BLRV-F/BLRV-R為引物進(jìn)行常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增。在25 μL的RT-PCR反應(yīng)體系中,cDNA模板1 μL;Taq DNA聚合酶 0.5 μL;10×PCR Buffer 2.5 μL (2.5 mmol·L-1MgCl2); dNT Ps 1 μL (10 mmol·L-1);上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL;ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序:94 ℃4 min,94 ℃ 45 s,51 ℃ 45 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次;最后72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物,使用凝膠成像系統(tǒng)拍攝并記錄。

    1.3 序列測定及分析

    經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,切取特異性目的條帶,采用快速凝膠回收純化試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)回收、純化后,再與載體Trans1-T1(TRANS)在常溫下連接25 min,繼而進(jìn)行轉(zhuǎn)化、涂板、藍(lán)白斑篩選,將篩選到的含正確插入片段的質(zhì)粒送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測定。運(yùn)用DNAMAN8.0軟件將測序獲得的序列與GenBank中已提交的菜豆卷葉病毒代表性序列進(jìn)行核苷酸序列同源性對(duì)比分析,使用MEGA7.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,最終將獲得的序列提交至Bankit獲得序列登錄號(hào)(MK263743.1)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病株癥狀

    栽培苜蓿通常第1年不表現(xiàn)癥狀,第2年春季返青后即可表現(xiàn)癥狀,相對(duì)于健康苜蓿植株,疑似病毒病的苜蓿植株矮小,枝條細(xì)弱,葉片邊緣呈皺縮或有波紋的卷曲狀,常伴有花葉或黃化斑駁,發(fā)病嚴(yán)重的甚至無法開花(圖1)。

    圖1 苜蓿卷葉病毒病田間癥狀Figure 1 Symptoms of alfalfa leafroll virus disease in the field

    2.2 RT-PCR檢測

    對(duì)苜蓿病株樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測,用引物BLRV-F/BLRV-R可以擴(kuò)增出大小約為1 000 bp的特異性條帶(圖2)。

    圖2 BLRV RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 2 RT-PCR amplification of bean leafroll virus(BLRV)

    2.3 BLRV外殼基因片段序列測定及分析

    提取采集的疑似卷葉病毒病的苜蓿樣品總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物回收純化、克隆和序列測定。測序結(jié)果表明:從新疆苜蓿疑似感染BLRV的樣品中得到長955 bp的特異性片段,G+C含量為49.7%。經(jīng)序列比對(duì),所得核苷酸序列與已報(bào)道的豆科植物上菜豆卷葉病毒(BLRV)分離物核苷酸序列同源性介于85.1%~96.5%。其中與阿根廷苜蓿BLRV分離物(KR261610.1)、美國豌豆BLRV分離物(HM439776.1)和(GQ404380.1)、澳大利亞苜蓿BLRV分離物(MF075256.1)序列同源性分別為96.5%、93.0%、92.7.%和89.2% (表1)。

    2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和分析

    運(yùn)用MEGA7.0軟件中鄰接法將新疆苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)外殼蛋白基因序列與GenBank中已報(bào)道的相同基因部分序列以及苜?;ㄈ~病毒[18](MF075254.1)、苜蓿矮化病毒[10](FJ15933.1)、苜蓿卷葉病毒[22](KX574859)外殼蛋白基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。經(jīng)序列比較分析,從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可見(圖3),新疆侵染苜蓿的菜豆卷葉病毒BLRV-XJ分離物(MK263743)與希臘菜豆卷葉病毒(KT382814.1、HE601635.1、KT382812.1)分離物進(jìn)化樹關(guān)系最近,在同一進(jìn)化分支上,故將其鑒定為菜豆卷葉病毒(bean leafroll virus),同屬于黃癥病毒科(Luteoviridae)黃癥病毒屬(Luteovirus)。

    表1 新疆BLRV分離物外殼蛋白基因核苷酸序列與已報(bào)道BLRV分離物同源性比較Table 1 Comparison of the homology between the nucleotide sequence of the coat protein gene of bean leafroll virus (BLRV) isolates in Xinjiang and the reported BLRV isolates

    圖3 用鄰接法構(gòu)建的新疆菜豆卷葉病毒紫花苜蓿分離物外殼蛋白基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on the coat protein gene of the bean leafroll virus (BLRV)isolates on alfalfa in Xinjiang

    3 討論與結(jié)論

    截至2015年,我國苜蓿種植面積達(dá)到470.8萬hm2[23]。新疆是我國苜蓿種植的主要產(chǎn)地之一,近幾年苜蓿病毒病的發(fā)生越發(fā)嚴(yán)重,但病原報(bào)道不多。本研究利用菜豆卷葉病毒(BLRV)特異性引物對(duì)新疆苜蓿疑似病毒病植株進(jìn)行PCR檢測,擴(kuò)增出長955 bp特異條帶,測序序列比對(duì)結(jié)果與菜豆卷葉病毒(BLRV)同源性較高,與Trucco等[9]報(bào)道的阿根廷侵染苜蓿的BLRV(KR261610.)同源性最高。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知,新疆侵染苜蓿的菜豆卷葉病毒BLRV(MK263743)與已知豆科植物中的菜豆卷葉病毒聚為一類。該結(jié)果證明了新疆栽培苜蓿疑似卷葉病毒病的病原為菜豆卷葉病毒(BLRV)。阿根廷、伊朗、澳大利亞曾報(bào)道菜豆卷葉病毒侵染苜蓿[9,12,18],本研究結(jié)果首次證實(shí)該病毒在中國侵染苜蓿,豐富了苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)在中國新疆地區(qū)基因組序列信息,對(duì)今后的檢測提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

    目前,國內(nèi)苜蓿種子供應(yīng)量還有所不足,苜蓿干草也是我國進(jìn)口草產(chǎn)品中的主打產(chǎn)品[24]。苜蓿種子和干草常常是病原的直接傳播來源,我國苜蓿種子進(jìn)口國家有美國、澳大利亞、西班牙和加拿大等[25]。文朝慧等[26]利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析結(jié)合RT-PCR方法從52份紫花苜蓿種子樣品中檢測到45份攜帶有苜?;ㄈ~病毒(AMV)、3份攜帶菜豆黃花葉病毒(BYMV)。苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)很可能隨著進(jìn)口苜蓿種子和苜蓿干草的引進(jìn)傳入我國并引起危害,相關(guān)部門應(yīng)引起足夠重視。

    病毒是一類傳染性很強(qiáng)的植物病原生物,通過對(duì)病毒病的檢測,可及早發(fā)現(xiàn)感病植物體內(nèi)病毒的存在,對(duì)病害的防治以及深入研究病毒的病理特點(diǎn)具有重要的意義。目前我國對(duì)苜蓿病毒病的研究較少,在今后的工作中還需要進(jìn)一步開展檢測和防治技術(shù)研究。苜蓿病毒病對(duì)我國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在較大的威脅,確認(rèn)不同病毒之間的聯(lián)系以及病毒復(fù)合侵染問題還需要進(jìn)一步研究,為苜蓿病毒病害檢測及其防治奠定基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    卷葉花葉病毒菜豆
    蔬菜不好管 這幾招專治徒長、黃葉、卷葉
    卷葉象鼻蟲的樹葉搖籃
    藜草花葉病毒的研究概述
    中國蔬菜(2016年8期)2017-01-15 14:23:34
    卷葉黃精根水提物理化特性及其功能飲品開發(fā)探討
    我國甜菜花葉病毒基因與馬鈴薯Y病毒屬其它家族序列的比較與分析
    中國糖料(2015年6期)2015-11-25 08:40:58
    西藏卷葉黃精莖內(nèi)鏈格孢屬真菌生物學(xué)特性研究
    西藏科技(2015年9期)2015-09-26 12:15:34
    芯片技術(shù)檢測黃瓜花葉病毒、煙草花葉病毒和馬鈴薯Y病毒
    菜豆采后生理及貯藏技術(shù)的研究進(jìn)展
    春播菜豆如何實(shí)現(xiàn)一播全苗
    長江蔬菜(2013年23期)2013-03-11 15:09:39
    殼寡糖膦酸酯對(duì)煙草花葉病毒抗性及其機(jī)理的初步研究
    黄片小视频在线播放| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日韩中文字幕欧美一区二区| 在线观看免费视频日本深夜| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美午夜高清在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 日韩高清综合在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 校园春色视频在线观看| 在线播放国产精品三级| 精品国产国语对白av| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 日韩免费av在线播放| 欧美一区二区精品小视频在线| 在线观看一区二区三区| 99热只有精品国产| 午夜福利免费观看在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲人成电影观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产区一区二久久| 亚洲在线自拍视频| 不卡av一区二区三区| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲精品在线美女| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品久久久久久,| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 丁香欧美五月| 亚洲av成人av| 免费高清在线观看日韩| 国产伦人伦偷精品视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 操出白浆在线播放| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久影院123| 啦啦啦韩国在线观看视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 成人国产综合亚洲| 激情视频va一区二区三区| 日韩精品青青久久久久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久亚洲精品不卡| 亚洲国产看品久久| 亚洲国产看品久久| 亚洲,欧美精品.| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久久久久久精品吃奶| 国产精华一区二区三区| 制服诱惑二区| 99久久综合精品五月天人人| 久久国产精品人妻蜜桃| 99国产精品99久久久久| 色av中文字幕| 欧美中文日本在线观看视频| 天堂影院成人在线观看| 无限看片的www在线观看| 国产三级在线视频| 国产成人精品久久二区二区91| 99久久综合精品五月天人人| 欧美成人午夜精品| 国产成年人精品一区二区| 91国产中文字幕| 九色国产91popny在线| 午夜两性在线视频| 国产精品日韩av在线免费观看 | 亚洲成人免费电影在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 日本 欧美在线| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲五月色婷婷综合| 久久天堂一区二区三区四区| 女警被强在线播放| 在线观看舔阴道视频| 亚洲少妇的诱惑av| 夜夜爽天天搞| 成人18禁在线播放| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 免费高清在线观看日韩| 成人国语在线视频| 手机成人av网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久性视频一级片| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲 国产 在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 88av欧美| 99精品久久久久人妻精品| 国产片内射在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 男男h啪啪无遮挡| 乱人伦中国视频| 久久中文字幕一级| 在线播放国产精品三级| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 中文字幕色久视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 99热只有精品国产| e午夜精品久久久久久久| 久久青草综合色| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产欧美日韩一区二区三| 51午夜福利影视在线观看| 精品久久久久久成人av| 老司机靠b影院| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品久久久精品久久久| 搡老岳熟女国产| 免费搜索国产男女视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜福利在线观看吧| 午夜成年电影在线免费观看| ponron亚洲| 露出奶头的视频| 欧美中文日本在线观看视频| 激情视频va一区二区三区| 在线天堂中文资源库| 亚洲欧美激情综合另类| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 一级作爱视频免费观看| 757午夜福利合集在线观看| 免费av毛片视频| tocl精华| xxx96com| 夜夜夜夜夜久久久久| 在线永久观看黄色视频| 亚洲精品美女久久av网站| 一本久久中文字幕| 婷婷丁香在线五月| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产三级黄色录像| 午夜免费激情av| 欧美一级毛片孕妇| 香蕉久久夜色| 最好的美女福利视频网| 丝袜美腿诱惑在线| 最新在线观看一区二区三区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 91成人精品电影| 国产成人精品在线电影| 国产色视频综合| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 在线永久观看黄色视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产麻豆成人av免费视频| 丝袜美足系列| 一进一出抽搐gif免费好疼| 免费高清视频大片| 青草久久国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日本黄色视频三级网站网址| 国产91精品成人一区二区三区| 电影成人av| 国产高清videossex| 女同久久另类99精品国产91| 国产私拍福利视频在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 麻豆av在线久日| 多毛熟女@视频| 手机成人av网站| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 大型黄色视频在线免费观看| 黄色视频不卡| 中文字幕人妻熟女乱码| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久国产精品影院| 国产私拍福利视频在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 色播在线永久视频| 看黄色毛片网站| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 最近最新中文字幕大全电影3 | xxx96com| 国产精品国产高清国产av| 亚洲 国产 在线| 露出奶头的视频| 精品国产一区二区久久| 可以在线观看毛片的网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 在线永久观看黄色视频| 久久久久国内视频| 欧美久久黑人一区二区| 国产视频一区二区在线看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久精品影院6| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 免费观看精品视频网站| 国产又爽黄色视频| 国产成人av教育| 在线av久久热| 国产亚洲精品av在线| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久人人精品亚洲av| 大陆偷拍与自拍| svipshipincom国产片| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 老司机午夜福利在线观看视频| 激情在线观看视频在线高清| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 18禁观看日本| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲性夜色夜夜综合| 精品久久蜜臀av无| 999久久久国产精品视频| 日本a在线网址| 制服人妻中文乱码| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 男人操女人黄网站| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久热这里只有精品99| 中文字幕人妻熟女乱码| 成年版毛片免费区| av有码第一页| 国产人伦9x9x在线观看| 精品人妻1区二区| 一级片免费观看大全| 午夜久久久久精精品| 国产一区二区三区视频了| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产男靠女视频免费网站| 免费看十八禁软件| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲男人天堂网一区| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日本 欧美在线| 可以在线观看毛片的网站| 久久人人精品亚洲av| 视频在线观看一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲国产精品久久男人天堂| 成人三级黄色视频| 99久久国产精品久久久| 妹子高潮喷水视频| 一级,二级,三级黄色视频| 热re99久久国产66热| 国产免费av片在线观看野外av| 三级毛片av免费| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久久国产精品麻豆| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久午夜亚洲精品久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 天天添夜夜摸| 国产激情欧美一区二区| 国产私拍福利视频在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产成人欧美| 丝袜人妻中文字幕| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 日日爽夜夜爽网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久99久视频精品免费| 激情在线观看视频在线高清| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲午夜理论影院| 久久精品国产清高在天天线| 午夜精品久久久久久毛片777| 老司机福利观看| 亚洲avbb在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 视频在线观看一区二区三区| 日本三级黄在线观看| 精品人妻1区二区| 禁无遮挡网站| 岛国在线观看网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 91在线观看av| 露出奶头的视频| 久久影院123| 亚洲第一av免费看| 女人精品久久久久毛片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美日韩一级在线毛片| 国产午夜福利久久久久久| av视频在线观看入口| 一级毛片高清免费大全| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产精品一区二区三区四区久久 | av片东京热男人的天堂| 91字幕亚洲| 亚洲五月婷婷丁香| 在线观看66精品国产| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产又色又爽无遮挡免费看| 狂野欧美激情性xxxx| 成人国产一区最新在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美成人午夜精品| 最近最新免费中文字幕在线| 国产精品国产高清国产av| 日韩视频一区二区在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 精品福利观看| 久久久久久久精品吃奶| 欧美国产精品va在线观看不卡| videosex国产| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 窝窝影院91人妻| 亚洲片人在线观看| 人妻久久中文字幕网| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 无人区码免费观看不卡| 精品电影一区二区在线| 99精品久久久久人妻精品| 日日爽夜夜爽网站| 少妇 在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产1区2区3区精品| 女警被强在线播放| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 欧美日韩乱码在线| 色播在线永久视频| АⅤ资源中文在线天堂| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 精品乱码久久久久久99久播| 久久人妻av系列| 日韩欧美一区视频在线观看| 高清在线国产一区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日本在线视频免费播放| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 久久精品国产清高在天天线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 久久人人精品亚洲av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 午夜精品国产一区二区电影| 操出白浆在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品久久蜜臀av无| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 村上凉子中文字幕在线| 性少妇av在线| 午夜影院日韩av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 最好的美女福利视频网| 欧美黄色淫秽网站| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久狼人影院| 午夜成年电影在线免费观看| 国产免费av片在线观看野外av| 日本在线视频免费播放| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久热在线av| 亚洲久久久国产精品| 欧美久久黑人一区二区| 日韩三级视频一区二区三区| 波多野结衣巨乳人妻| 久久久久久国产a免费观看| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 9191精品国产免费久久| 日韩欧美免费精品| 一本综合久久免费| 国产一卡二卡三卡精品| 国产片内射在线| 国产一卡二卡三卡精品| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久久久久久午夜电影| 久久久久久久久免费视频了| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲熟妇熟女久久| 精品高清国产在线一区| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品国产高清国产av| 亚洲五月天丁香| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜福利在线观看吧| 精品不卡国产一区二区三区| 国产色视频综合| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 日本欧美视频一区| 日本三级黄在线观看| 国内精品久久久久精免费| 无人区码免费观看不卡| 久久人妻av系列| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲av五月六月丁香网| 精品人妻在线不人妻| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲国产精品999在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲avbb在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产精品免费一区二区三区在线| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产亚洲欧美在线一区二区| 免费在线观看亚洲国产| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产97色在线日韩免费| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 人人妻人人澡人人看| 欧美性长视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 91国产中文字幕| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 黄片大片在线免费观看| 一区二区三区国产精品乱码| 国产真人三级小视频在线观看| 日本 av在线| www.www免费av| 91九色精品人成在线观看| 99热只有精品国产| 婷婷丁香在线五月| 亚洲全国av大片| 国产成人精品无人区| 色播在线永久视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 一区在线观看完整版| 欧美日韩精品网址| 国产一区二区三区综合在线观看| 级片在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 91在线观看av| 免费av毛片视频| 国产单亲对白刺激| 久久久久久免费高清国产稀缺| cao死你这个sao货| 中文字幕高清在线视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 91成年电影在线观看| 久久影院123| 涩涩av久久男人的天堂| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲av美国av| 大码成人一级视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 最近最新免费中文字幕在线| 不卡av一区二区三区| 一区二区日韩欧美中文字幕| bbb黄色大片| 在线观看66精品国产| 丝袜美腿诱惑在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 搡老岳熟女国产| 99久久国产精品久久久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲av熟女| 91在线观看av| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲国产中文字幕在线视频| 韩国精品一区二区三区| 18美女黄网站色大片免费观看| 韩国av一区二区三区四区| 一二三四社区在线视频社区8| 久久草成人影院| 大型黄色视频在线免费观看| 1024视频免费在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲av成人av| 亚洲第一电影网av| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久精品91蜜桃| 一夜夜www| 国产成人精品久久二区二区免费| 一进一出好大好爽视频| av福利片在线| 日本黄色视频三级网站网址| 电影成人av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 一个人免费在线观看的高清视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲片人在线观看| x7x7x7水蜜桃| 在线观看www视频免费| 69av精品久久久久久| 国产亚洲精品av在线| 91精品三级在线观看| 正在播放国产对白刺激| 国产又爽黄色视频| 亚洲一区高清亚洲精品| av天堂在线播放| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美日韩黄片免| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲一码二码三码区别大吗| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 伦理电影免费视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 美国免费a级毛片| 久久久久久国产a免费观看| 久久热在线av| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美中文综合在线视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| av片东京热男人的天堂| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 日韩av在线大香蕉| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 黑丝袜美女国产一区| 国产精品野战在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品永久免费网站| 日本 av在线| 国产激情久久老熟女| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美另类亚洲清纯唯美| av欧美777| 美女扒开内裤让男人捅视频| 一级a爱片免费观看的视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 此物有八面人人有两片| 热99re8久久精品国产| 少妇粗大呻吟视频| 欧美色视频一区免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲五月天丁香| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲人成电影观看| 亚洲三区欧美一区| 91国产中文字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99精品久久久久人妻精品| 乱人伦中国视频| 首页视频小说图片口味搜索| 国产真人三级小视频在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 久久天堂一区二区三区四区| 淫妇啪啪啪对白视频| 女性生殖器流出的白浆| 免费在线观看日本一区| 久久天堂一区二区三区四区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 好男人在线观看高清免费视频 | 韩国精品一区二区三区| aaaaa片日本免费| 精品人妻1区二区| 久久草成人影院| av在线播放免费不卡| 国产精品永久免费网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产成人av激情在线播放| 免费高清视频大片| 亚洲色图综合在线观看| 变态另类丝袜制服| 久久国产亚洲av麻豆专区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 精品高清国产在线一区| 国产精品av久久久久免费| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产乱人伦免费视频| 久久精品91无色码中文字幕| 国产精品98久久久久久宅男小说| cao死你这个sao货| 亚洲色图av天堂| 亚洲国产精品成人综合色| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲七黄色美女视频| 搞女人的毛片| 狠狠狠狠99中文字幕| 色老头精品视频在线观看| 69av精品久久久久久| 亚洲专区国产一区二区|