ERβ激動(dòng)劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究①

肖美芳 陸 喆 王 敏 李 玲

(海南省婦幼保健院檢驗(yàn)科,?？?571206)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，主要特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)脫髓鞘和小血管周?chē)鷨魏思?xì)胞浸潤(rùn)，在中青年人群中多發(fā)，多數(shù)患者經(jīng)歷復(fù)發(fā)緩解、然后繼發(fā)進(jìn)展階段，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷不可恢復(fù)[1]。該病的病因尚不清楚，主要集中在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)上。有研究顯示雌激素及其受體在腦脊髓組織中發(fā)揮重要作用，雌激素可有效治療老年癡呆癥、帕金森病、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，雌激素主要通過(guò)雌激素受體發(fā)揮作用[2,3]，發(fā)現(xiàn)ERα是雌激素發(fā)揮中樞神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵受體[4]，Moore等[5]研究發(fā)現(xiàn)ERβ激動(dòng)劑通過(guò)促進(jìn)髓鞘的形成發(fā)揮對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyeli-tis，EAE)小鼠動(dòng)物模型的治療作用。本文對(duì)ERβ激動(dòng)劑對(duì)EAE小鼠的保護(hù)作用及其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和氧化應(yīng)激的影響進(jìn)行研究，探討ERβ激動(dòng)劑對(duì)EAE小鼠的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡90只健康雌性C57BL/6小鼠、體重18～21 g、購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2007-0001。

1.1.2主要試劑 DPN(美國(guó)Santa Cruz公司)，二甲基亞砜、完全弗氏佐劑、免疫組化試劑盒、羊抗小鼠Iba-1抗體、兔抗小鼠iNOS抗體、兔抗羊IgG-HRP多聚體、山羊抗兔IgG-HRP多聚體(美國(guó)Sigma公司)，卡介苗(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)35-55多肽(西安美聯(lián)多肽合成有限公司)，百日咳毒素(成都生物制品研究所)，MDA檢測(cè)試劑盒(北京碧云天生物科技有限公司)等。

1.2方法

1.2.1小鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù) 將每只小鼠采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部?jī)蓚?cè)各行2 cm左右切口，將輸卵管組織連同脂肪組織一起結(jié)扎，剪除卵巢組織，縫合傷口，2周后建立EAE小鼠模型。

小鼠分組：將90只小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和DPN組，每組30只。

1.2.2EAE小鼠模型建立及處理 模型組和DPN組小鼠建立模型：用PBS稀釋MOG35-55濃度為300 μg/ml，與等量完全弗氏佐劑混合，用注射器抽打呈油包水狀態(tài)抗原乳劑，每只小鼠分別于免疫0 d和7 d在小鼠頸部、背部、腋窩、膝部皮下注射抗原乳劑0.2 ml，免疫0 d、2 d腹腔注射0.4 mg百日咳毒素，制備實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型；對(duì)照組小鼠于免疫0 d和7 d在小鼠頸部、背部、腋窩、膝部皮下注射等量PBS液，免疫0 d、2 d腹腔注射等量生理鹽水、DPN組小鼠于免疫當(dāng)日起皮下注射0.5 ml DPN(根據(jù)小鼠體重，按30 nmol/100 g計(jì)算DDN的量，并溶解于0.5 ml 二甲基亞砜中)，每周2次，共3周；對(duì)照組和模型組小鼠同樣方法皮下注射等量二甲基亞砜。

1.2.3臨床癥狀評(píng)分 各組小鼠自免疫當(dāng)天起每天早晚稱(chēng)重，觀察小鼠運(yùn)動(dòng)、攝食、發(fā)病情況直至小鼠被處死，采用雙盲法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分：其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為尾巴無(wú)異常為0分，尾巴半癱為1分，尾巴全癱為2分；四肢：無(wú)異常為0分，步態(tài)改變?yōu)?分，輕度癱瘓為2分，全癱為3分，四個(gè)肢體分別進(jìn)行評(píng)分，并累加；死亡為15分。

1.2.4各組小鼠腰髓HE染色 每組取10只小鼠，免疫3周后處死，取腰髓組織經(jīng)多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成厚5 μm切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，根據(jù)光學(xué)顯微鏡下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行炎癥反應(yīng)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：沒(méi)有炎癥反應(yīng)為0分，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)局限在軟脊膜和血管周?chē)鸀?分，脊髓內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為1～10個(gè)/視野為2分，脊髓內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為11～100個(gè)/視野為3分，脊髓內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)>100個(gè)/視野為4分。每張切片取6個(gè)高倍視野的平均值。

1.2.5小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba-1和iNOS蛋白表達(dá)測(cè)定 每組取10只小鼠，采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定小鼠腦組織Iba-1和iNOS蛋白表達(dá)情況：將小鼠腦組織切片常規(guī)脫蠟脫水，H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，檸檬酸鹽修復(fù)抗原，血清封閉，加入羊抗小鼠Iba-1一抗和兔抗小鼠iNOS一抗，過(guò)夜孵育，滴加二抗：兔抗羊IgG-HRP多聚體(Iba-1)、山羊抗兔IgG-HRP多聚體(iNOS)孵育20 min，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡下觀察Iba-1和iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，每張切片選5個(gè)400倍高倍視野計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。腦組織MDA含量測(cè)定：每組取10只小鼠處死取腦組織，采用比色法測(cè)定腦組織MDA含量。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠發(fā)病情況及臨床癥狀評(píng)分比較 對(duì)照組小鼠活動(dòng)正常，未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損臨床癥狀，體重正常增長(zhǎng)；模型組30只小鼠均發(fā)病，最早臨床癥狀出現(xiàn)在免疫后10 d，發(fā)病小鼠臨床癥狀為活動(dòng)量減少、食欲下降、體重減輕，毛色暗淡，尾部遠(yuǎn)端張力下降、尾部癱瘓，后肢無(wú)力、甚至癱瘓，嚴(yán)重者出現(xiàn)前肢癱瘓、瀕臨死亡等；DPN組30只小鼠18只出現(xiàn)臨床癥狀，剩下12只未發(fā)病。DPN組小鼠臨床癥狀評(píng)分[(1.52±0.34)分]明顯低于模型組[(3.24±0.64)分](t=13.000，P=0.000)。

2.2各組小鼠HE染色及炎癥反應(yīng)評(píng)分比較 對(duì)照組小鼠腰髓HE染色未見(jiàn)明顯異常，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠腰髓實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；DPN組小鼠見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DPN組小鼠腰髓炎癥反應(yīng)評(píng)分[(1.32±0.65)分]低于模型組[(4.21±0.87)分](t=8.415，P=0.000)。見(jiàn)圖1。

2.3各組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況比較 與對(duì)照組比較，模型組和DPN組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞增多(P<0.05)，與模型組比較，DPN組小鼠Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞減少(P<0.05)。光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組小鼠脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)少量小膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞的分枝樣突起細(xì)小；模型組小鼠脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞增多，突起較對(duì)照組明顯，染色加深，呈“阿米巴”狀；DPN組小鼠脊髓實(shí)質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞較模型組明顯減少。見(jiàn)表1和圖1。

圖1 各組小鼠腦組織HE染色和免疫組化染色Fig.1 HE staining and immunohistochemical staining of brain tissue of mice in each groupNote: A.Brain tissue HE staining(×40)；B.Brain tissue microglia activation immunohistochemical staining (×400)；C.Brain tissue iNOS immunohistochemical staining (×400).

表1 各組小鼠Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、MDA含量比較(n=10)

Tab.1 Comparison of number of Iba-1 positive cells,iNOS positive cells and MDA content in each group of mice(n=10)

GroupsNumber of Iba-1positive cells(cells)Number of iNOSpositive cells(cells)MDA contentControl group6.13±1.2713.24±2.531.37±0.32Model group20.04±3.5262.71±9.243.41±0.58DPN group13.62±2.1427.38±6.472.16±0.28F8.027145.74461.371P0.0000.0000.000

2.4各組小鼠腦組織iNOS蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組小鼠腦組織有少量iNOS蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，模型組小鼠腦組織iNOS蛋白陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組和DPN組小鼠腦組織iNOS蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高(P<0.05)，與模型組比較，DPN組小鼠腦組織iNOS蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

2.5各組小鼠MDA含量比較 與對(duì)照組比較，模型組和DPN組小鼠MDA含量升高(P<0.05)，與模型組比較，DPN組小鼠MDA含量降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.6腦組織中Iba-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與iNOS蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相關(guān)性 腦組織中Iba-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與iNOS蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)(r=0.623，P<0.001)。

3 討論

MS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性脫髓鞘疾病，病變累及大腦半球白質(zhì)、脊髓、視神經(jīng)、腦干以及小腦，病理特征為局灶性脫髓鞘、炎癥反應(yīng)、軸索受損、神經(jīng)功能損傷，EAE與MS的組織病理學(xué)特征和免疫學(xué)特征相似[6，7]，是MS最有價(jià)值的疾病模型。

雌激素可有效緩解女性多發(fā)性硬化的病情，對(duì)MS具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能為雌激素通過(guò)與ER元件作用，促進(jìn)下丘腦-垂體-腎上腺軸釋放糖皮質(zhì)激素，協(xié)同雌激素抑制MS；另外雌激素可直接與ER發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[8，9]。ER有ERα和ERβ兩種類(lèi)型，研究發(fā)現(xiàn)這兩種受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)中發(fā)揮不同的調(diào)控作用，大量研究發(fā)現(xiàn)ERα可通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性等發(fā)揮對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用[10，11]。Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)ERβ，小膠質(zhì)細(xì)胞的ERβ是人參皂甙發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用的基礎(chǔ)；Hidalgo-Lanussa等[13]研究發(fā)現(xiàn)替勃龍通過(guò)ERβ減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷和炎癥反應(yīng)；Moore等[5]研究認(rèn)為ERβ激動(dòng)劑吲唑氯化物可通過(guò)刺激內(nèi)源性髓鞘形成發(fā)揮對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)ERβ激動(dòng)劑DPN治療EAE小鼠可改善小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，減輕中樞炎癥反應(yīng)，表明ERβ激動(dòng)劑DPN對(duì)EAE小鼠中樞神經(jīng)具有保護(hù)作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，具有產(chǎn)生促炎因子、抗原呈遞等功能[14]，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與EAE的炎癥損害關(guān)系密切，小膠質(zhì)細(xì)胞受到刺激后變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，形態(tài)上體積變大、胞體變圓，具有吞噬和變形作用[15，16]；功能上可大量表達(dá)炎癥因子、抗原提呈和識(shí)別有關(guān)的特異性膜表面分子，啟動(dòng)免疫反應(yīng)，還可釋放活性氧族，生成大量iNOS，通過(guò)“呼吸爆發(fā)”現(xiàn)象產(chǎn)生大量的氧自由基，造成脂質(zhì)過(guò)氧化，發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，加重炎癥反應(yīng)，最終引起脫髓鞘和中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他病理?yè)p傷[17,18]。iNOS蛋白表達(dá)程度與實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的損害嚴(yán)重程度有關(guān)，iNOS陽(yáng)性細(xì)胞在疾病發(fā)展過(guò)程中主要在脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)壞死組織中表達(dá)，參與髓鞘脫失和組織損傷過(guò)程[19，20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)EAE小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞和iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而ERβ激動(dòng)劑DPN干預(yù)后小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞和iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，表明ERβ激動(dòng)劑DPN通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化、降低iNOS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮對(duì)EAE小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。本文還發(fā)現(xiàn)腦組織活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與iNOS蛋白呈正相關(guān)，表明降低iNOS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)。

EAE發(fā)生的氧化應(yīng)激可引起髓鞘脫失、神經(jīng)元和軸索損傷等，從而引起病理?yè)p害，MDA是氧自由基和生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)以及氧化應(yīng)激程度，在機(jī)體受到外界刺激或病理?xiàng)l件下，氧化-抗氧化平衡被破壞，體內(nèi)過(guò)剩的氧自由基可以使多不飽和脂肪酸中的不飽和鍵氧化，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物MDA對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)有嚴(yán)重的損害作用[21，22]。本研究發(fā)現(xiàn)EAE小鼠腦組織中MDA含量升高，而ERβ激動(dòng)劑DPN干預(yù)后小鼠腦組織中MDA含量減少，表明ERβ激動(dòng)劑DPN可通過(guò)減輕腦組織氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮對(duì)EAE小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，ERβ激動(dòng)劑DPN干預(yù)對(duì)EAE小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與小膠質(zhì)細(xì)胞活化和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。