白藜蘆醇抗骨肉瘤細(xì)胞增殖及增強(qiáng)其免疫原性的研究①

童晨曦 姜曉玲 劉 美 陳昌蓉 曾 艷 宋銀宏

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原與免疫學(xué)系，三峽大學(xué)感染與炎癥損傷研究所,宜昌 443002)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一種多發(fā)生于兒童和青少年的骨惡性腫瘤，其惡性程度極高。目前，骨肉瘤的主要治療方案是手術(shù)和放化療。多種治療手段的發(fā)展使患者的5年生存率提高到60%，但發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者5年生存率小于20%[1]。對(duì)抗癌療法產(chǎn)生抗性是造成腫瘤轉(zhuǎn)移和患者死亡的主要原因，其發(fā)生機(jī)制與免疫系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)也息息相關(guān)[2]。因此，研究具有選擇性細(xì)胞毒性的藥物對(duì)治療骨肉瘤具有實(shí)際意義。白藜蘆醇(Resveratrol,RES)是一種來(lái)自葡萄、桑葚、花生和其他植物的天然植物多酚化合物，作用十分廣泛，其對(duì)抗炎、抗氧化等都有一定功效[3]。而白藜蘆醇的抗癌特性更是引起了很大關(guān)注。有文獻(xiàn)報(bào)道白藜蘆醇對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，如卵巢癌、皮膚癌[4-6]。對(duì)于骨肉瘤，也有研究組開(kāi)展了白藜蘆醇對(duì)骨肉瘤抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究。但是對(duì)其是否能增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的免疫原性和體內(nèi)的免疫應(yīng)答并不是十分清楚。本研究進(jìn)一步探討了白藜蘆醇對(duì)骨肉瘤K7M2細(xì)胞系的抗增殖作用，并對(duì)白藜蘆醇增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的免疫原性進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠骨肉瘤細(xì)胞株K7M2購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。BALB/c 小鼠(雌性，6～8 周齡，體重約16～18 g)購(gòu)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：42010200001767。

1.1.2主要試劑和儀器 白藜蘆醇(成都克洛瑪生物科技有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco)；細(xì)胞凋亡試劑盒(BD公司)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；TRIzol Reagent(Invitrogen);PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PowerUpTM SYBR Green Master Mix(Thermo Scientific)；蛋白提取試劑盒(索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific);β-actin兔抗鼠單克隆抗體、CyclinE1兔抗鼠單克隆抗體和XIAP兔抗鼠單克隆抗體(Ruiying Biological)；Mcl-1兔抗鼠單克隆抗體、Bcl-2兔抗鼠單克隆抗體，Bax兔抗鼠單克隆抗體和Caspase-3兔抗鼠單克隆抗體(Cell signaling technology)；Kras兔抗鼠單克隆抗體(Abcam)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(谷歌生物科技有限公司)；H-2Kd-FITC (MHCⅠ),I-A/I-E-PE (MHCⅡ)(BD公司)；CD45-APC熒光單克隆抗體(Biolegend)；BD FACSVerse流式細(xì)胞儀(BD公司)；Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)；StepOnePlus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)；GelX凝膠成像系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) K7M2細(xì)胞用含 10% 胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。隔天換液，每隔2 d傳代一次。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種在96孔平底板中(6 000 個(gè)/孔)。分不同濃度組(80、40、20、10、5 μmol/L)的RES處理細(xì)胞24 h、48 h和72 h，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組用與藥物相同體積的DMSO處理。相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用含有10%MTT(5 mg/ml)溶液的150 μl新鮮培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基。在37℃溫育4 h后，除去MTT溶液，并用150 μl DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)甲瓚晶體。酶標(biāo)儀在570 nm處的測(cè)定每孔吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組均減去空白對(duì)照組(A)值后，計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=(陰性對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/陰性對(duì)照組×100%。

1.2.3細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) K7M2細(xì)胞用20 μmol/L和40 μmol/L的RES孵育48 h。設(shè)置單染組和對(duì)照組，對(duì)照組用與藥物相同體積的DMSO處理。用不含EDTA的消化酶消化后收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml，PBS洗滌2次，用100 μl 的1×Binding buffer重懸，然后加入2.5 μl PE和5 μl 7-AAD染液在25℃避光環(huán)境下孵育15 min。然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理組細(xì)胞凋亡變化。

1.2.4細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) K7M2細(xì)胞用20 μmol/L和40 μmol/L的RES培養(yǎng)48 h，對(duì)照組加入與藥物相同體積的DMSO。收集細(xì)胞PBS洗滌兩次，用70%乙醇于4℃固定一夜，用PI和RNase A溶液染色，流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理組細(xì)胞周期比例。

1.2.5實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈聚合反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)量 K7M2細(xì)胞用20 μmol/L和40 μmol/L的RES培養(yǎng)48 h，對(duì)照組加入與藥物相同體積的DMSO。用TRIzol從K7M2細(xì)胞中提取RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green Master Mix在StepOnePlus Real-Time PCR System儀器上進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。β-actin作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算Xiap、Kras、Bcl-2、Mcl-1、CyclinE1、Bax和Caspase-3相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR反應(yīng)條件：95℃ 45 s,56℃ 30 s,72℃ 3 min,40個(gè)循環(huán)。所有引物序列及相關(guān)信息見(jiàn)表1。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)量 K7M2細(xì)胞用20 μmol/L 和40 μmol/L的RES培養(yǎng)48 h，對(duì)照組加入與藥物相同體積的DMSO。用RIPA裂解液提取K7M2細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜上，置于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入相應(yīng)目的蛋白的一抗于4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次后二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色。IPP6.0對(duì)顯影出來(lái)的條帶進(jìn)行分析。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分子

1.2.7.1體外K7M2細(xì)胞系MHC分子的檢測(cè) K7M2細(xì)胞用20 μmol/L和40 μmol/L的RES處理48 h。收集細(xì)胞并設(shè)置對(duì)照組和單標(biāo)記組，對(duì)照組加入與藥物相同體積的DMSO。用熒光單克隆抗體H-2Kd-FITC (MHCⅠ)、I-A/I-E-PE(MHCⅡ)以1∶100 稀釋比例加入不同處理組，冰上避光孵育60 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組MHCⅠ類和MHCⅡ類分子表達(dá)變化。

1.2.7.2荷骨肉瘤小鼠模型腫瘤細(xì)胞MHC分子的檢測(cè) 6～8周齡，體重16～18 g雌性BALB/c小鼠按體重隨機(jī)分為3組。高劑量治療組為100 mg/kg，低劑量治療組為50 mg/kg，對(duì)照組注射含藥物相同體積DMSO的PBS溶液。首先構(gòu)建荷骨肉瘤小鼠模型，體外培養(yǎng)的K7M2細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，取200 μl細(xì)胞懸液注射于小鼠右側(cè)腋窩皮下。用游標(biāo)卡尺測(cè)量體積，當(dāng)瘤體體積≥0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm，判斷荷瘤成功。每日稱量體重后，將藥物用PBS溶液按分組劑量配制好后，每只取200 μl于瘤周皮下注射，注射用藥16 d，頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌取腫瘤組織剪碎、研磨擠壓成單細(xì)胞懸液后,離心、棄掉上清。300 g 離心 5 min 后棄上清收集細(xì)胞,不同處理組分別加入1∶100 稀釋的單克隆抗體組合(H-2Kd-FITC、I-A/I-E-PE和CD45-APC),4℃避光反應(yīng)60 min，各管加入 3 ml PBS重懸,300 g離心5 min后棄上清,重復(fù)2次;上流式細(xì)胞儀分析不同組腫瘤細(xì)胞(CD45-)MHC分子表達(dá)變化。

表1 PCR引物

Tab.1 PCR primers

GenePrimer sequence(5′-3′)β-actin F:GTGGATCAGCAAGCAGGAGTR:GTGGATCAGCAAGCAGGAGTXiapF:TTGGAACATGGACATCCTCAR:TACCACTTCGCATGCTGTTCKrasF:AGAGCGCCTTGACGATACAGR:CCCTCCCCAGTTCTCATGTAMcl-1F:CAAAGATGGCGTAACAACTGGR:CGTTTCGTCCTTACAAGAACABcl-2F:GATGACTGAGTACCTGAACCGR:CAGAGACAGCCAGGAGAAATCCyclinE1F:GCGAGGATGAGAGCAGTTCR:AAGTCCTGTGCCAAGTAGAACBaxF:CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAGR:CCAGCCCATGATGGTTCTGACaspase-3F:ACCATGGAGAACACTGAAR:TTAGTGATAAAAATAGAG

2 結(jié)果

2.1RES對(duì)骨肉瘤K7M2細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果如圖1所示，RES處理細(xì)胞24 h后，40 μmol/L及80 μmol/L兩個(gè)處理組的細(xì)胞增殖抑制率分別為38.24%及38.87%。處理細(xì)胞48 h后，20、40、80 μmol/L三個(gè)處理組的細(xì)胞抑制率均大于30%；處理細(xì)胞72 h后，5、10、20、40和80 μmol/L的RES均可顯著抑制K7M2細(xì)胞增殖。相同濃度RES作用K7M2細(xì)胞，抑制率隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，這說(shuō)明RES抑制骨肉瘤K7M2細(xì)胞增殖具有時(shí)間依賴性。

2.2RES對(duì)骨肉瘤K7M2細(xì)胞凋亡的影響 用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果如圖2所示，與DMSO組相比較，RES(20 μmol/L和40 μmol/L)組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01，P<0.001)，存活細(xì)胞顯著減少(P<0.05，P<0.001)，表明RES能顯著誘導(dǎo)骨肉瘤K7M2細(xì)胞凋亡。

2.3RES對(duì)骨肉瘤K7M2細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)與DMSO組相比較，RES(20 μmol/L和40 μmol/L)組S期的K7M2細(xì)胞均顯著增多(P<0.05，圖3)。表明RES能誘導(dǎo)骨肉瘤K7M2細(xì)胞周期阻滯在S期。

圖1 RES顯著抑制K7M2細(xì)胞增殖Fig.1 RES significantly inhibited K7M2 cell proliferationNote: Cell inhibition rate was determined by MTT assay.***.P<0.001.

2.4RES對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白表達(dá)量的影響 用后RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與DMSO組相比較，20 μmol/L RES處理組Xiap、Kras、Bcl-2和Mcl-1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.001，圖4A)，而Cy-clinE1、Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05，圖4B)；40 μmol/L RES處理組Xiap、Kras、Bcl-2和Mcl-1 mRNA表達(dá)水平同樣顯著降低(P<0.001、P<0.05、P<0.05、P<0.001，圖4A)，而CyclinE1、Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01、P<0.05、P<0.05，圖4B)。用Western blot檢測(cè)蛋白，結(jié)果如圖4C所示，與DMSO組相比較，RES(20 μmol/L和40 μmol/L)組Xiap、Kras、Bcl-2和Mcl-1的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而CyclinE1、Bax和Caspase-3 的蛋白水平表達(dá)顯著升高，同mRNA水平改變趨勢(shì)相一致。

圖2 RES顯著誘導(dǎo)K7M2細(xì)胞凋亡

Fig.2 RES significantly induced apoptosis in K7M2 cells

Note: Cell apoptosis and viability were determined by flow cytometry.Compared with group DMSO,n=3,*.P<0.05.**.P<0.01.***.P<0.001.

圖3 RES顯著誘導(dǎo)K7M2細(xì)胞周期阻滯于S期

Fig.3 RES significantly induced K7M2 cell cycle arrested at S phase

Note: Cell cycle was determined by flow cytometry.Compared with group DMSO,n=3,*.P<0.05.

2.5RES對(duì)體內(nèi)外骨肉瘤MHC分子表達(dá)的影響 用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MHC分子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與DMSO組相比較，RES(20 μmol/L和40 μmol/L)在體外處理K7M2細(xì)胞后，細(xì)胞的MHCⅠ類分子(圖5A)及MHCⅡ類分子(圖5B)的表達(dá)量均顯著增加(P<0.05、P<0.01；P<0.05、P<0.01)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組小鼠相比，RES(50 mg/kg和100 mg/kg)處理的荷骨肉瘤小鼠的腫瘤細(xì)胞MHCⅠ類分子表達(dá)量顯著增高(P<0.01、P<0.001，圖5C)，同時(shí)，MHCⅡ類分子表達(dá)量也顯著增高(P<0.01、P<0.001，圖5D)。表明RES能顯著增強(qiáng)體內(nèi)外骨肉瘤K7M2細(xì)胞的免疫原性。

圖4 RES對(duì)K7M2細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of RES on expression of mRNA and protein in K7M2 cellsNote: A，B.The expression of mRNA was determined by RT-qPCR.Compared with group DMSO.n=3，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.C.The expression of protein was determined by Western blot.

圖5 RES顯著增強(qiáng)體內(nèi)外K7M2細(xì)胞MHC分子表達(dá)Fig.5 RES significantly enhanced MHC molecule expression of K7M2 cellsNote: The expression of MHC was determined by flow cytometry.Compared with group DMSO.n=3，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展受一系列復(fù)雜機(jī)制的影響，其中包括原癌基因和腫瘤抑制基因的突變以及凋亡過(guò)程的改變，凋亡的累積同樣會(huì)影響細(xì)胞周期的穩(wěn)態(tài)。同時(shí)也與癌細(xì)胞的識(shí)別或腫瘤生長(zhǎng)同抗腫瘤免疫應(yīng)答之間的平衡有關(guān)[7]。那么對(duì)于宿主而言，抗腫瘤免疫就起著十分重要的作用。此前大量研究表明，化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞同期停滯和細(xì)胞凋亡[8,9]，而關(guān)于白藜蘆醇影響骨肉瘤免疫應(yīng)答的研究較少。本研究采用骨肉瘤K7M2細(xì)胞，首先體外檢測(cè)RES對(duì)K7M2細(xì)胞毒性作用，對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。發(fā)現(xiàn)用20 μmol/L和40 μmol/L RES處理K7M2細(xì)胞48 h后能夠有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞周期阻滯在S期。與此同時(shí)，與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平也發(fā)生了改變。Bcl-2、Bax和Mcl-1同屬于B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族，Bcl-2和Mcl-1發(fā)揮著抗凋亡作用，而B(niǎo)ax屬于促凋亡基因，共同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10]。X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是凋亡蛋白抑制劑(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中的一員，可直接抑制Caspase-3，并傳遞不依賴Caspase的信號(hào)。這樣，作為下游終末剪切酶效應(yīng)的Caspase-3就不能發(fā)揮其促進(jìn)凋亡發(fā)生的作用[11,12]。K-ras編碼一種調(diào)節(jié)增殖、分化和細(xì)胞存活的膜相關(guān)GTP酶信號(hào)蛋白，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，會(huì)導(dǎo)致預(yù)后不良[13]。CyclinE1作為細(xì)胞周期從G1期向S進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)因子，在大多數(shù)人類癌癥中表達(dá)，并與腫瘤發(fā)生相關(guān)[14]。本文發(fā)現(xiàn)20 μmol/L和40 μmol/L RES處理K7M2細(xì)胞48 h后，Mcl-1、Xiap、K-ras和Bcl-2 mRNA和蛋白水平明顯降低，而B(niǎo)ax和Caspase-3明顯增高，這些基因和蛋白的表達(dá)變化都能促使腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有趣的是，CyclinE1 mRNA和蛋白表達(dá)水平也顯著增加，這種變化可能也與在多細(xì)胞生物中，周期分裂是與外部環(huán)境和內(nèi)部細(xì)胞狀態(tài)相結(jié)合，細(xì)胞分裂過(guò)程中變化的類型也不盡相同有關(guān)[15]。還可能與其他周期蛋白(如細(xì)胞周期中CyclinD1和CyclinE1)表達(dá)的高低、相互調(diào)控以及腫瘤類型相關(guān)聯(lián)[16]。還有可能是某些惡性腫瘤本身的發(fā)展過(guò)程中CyclinE1的擴(kuò)增很少，藥物治療后會(huì)發(fā)生其他變化。當(dāng)然，徹底闡明其機(jī)制需要開(kāi)展更多的相關(guān)研究工作。但事實(shí)上，在本研究中CyclinE1的升高導(dǎo)致了G0/G1期細(xì)胞減少，細(xì)胞周期阻滯在S期，但G2/M期并無(wú)顯著改變。

許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在60%～90%的不同組織學(xué)起源的人類癌癥如頭頸部、皮膚、乳腺和肺中MHC Ⅰ 類分子表達(dá)下調(diào)或完全喪失[17,18]。具有下調(diào)MHC表達(dá)的癌癥有更大的轉(zhuǎn)移潛能，對(duì)患者預(yù)后不良[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在20 μmol/L和40 μmol/L RES處理K7M2細(xì)胞48 h后，體外培養(yǎng)的K7M2細(xì)胞系中MHC Ⅰ 類、MHC Ⅱ 類分子的表達(dá)量顯著增加。同樣的結(jié)果在體內(nèi)動(dòng)物研究也得到了驗(yàn)證。通過(guò)構(gòu)建荷骨肉瘤小鼠模型，50 mg/kg和100 mg/kg 的RES在腫瘤局部注射16 d后，發(fā)現(xiàn)荷骨肉瘤小鼠腫瘤細(xì)胞中MHC Ⅰ 和MHC Ⅱ 類分子的表達(dá)都顯著增高，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腫瘤逃避免疫識(shí)別的一個(gè)重要機(jī)制即是降低遞呈腫瘤抗原給細(xì)胞毒性T細(xì)胞的MHC Ⅰ 類分子的表達(dá)[21,22]，MHC Ⅰ 類表達(dá)增加，表明RES可減弱MHC Ⅰ 類分子低表達(dá)而產(chǎn)生的免疫逃逸。MHC Ⅱ類分子在腫瘤細(xì)胞中一般并不表達(dá)，而在RES處理后，MHC Ⅱ 類分子表達(dá)增多則被認(rèn)為是抗原提呈能力增強(qiáng)的表現(xiàn)，可能會(huì)增強(qiáng)免疫反應(yīng)[23]。我們推測(cè)，同MHC分子的改變一樣，體內(nèi)會(huì)有眾多免疫細(xì)胞的改變來(lái)對(duì)抗骨肉瘤。綜上所述，RES具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用，另外其也具有提高抗腫瘤免疫的潛力。本研究在動(dòng)物模型治療過(guò)程中也初步觀察到50 mg/kg和100 mg/kg的RES對(duì)小鼠骨肉瘤體積有抑制效應(yīng)，未來(lái)將在進(jìn)一步的研究中明確其治療效果。此外，在進(jìn)一步的研究中，還將檢測(cè)腫瘤組織中募集的免疫細(xì)胞變化，探討RES對(duì)骨肉瘤小鼠腫瘤的抑制作用及對(duì)抗腫瘤免疫是否有增強(qiáng)作用，并討論其可能的機(jī)制。