中央靜脈導管測量大鼠肺動脈壓方法詳解

劉 娟，李葉麗，羅云梅，楊丹莉，李利生

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學研究所，貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學 基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

循環(huán)系統(tǒng)由肺循環(huán)和體循環(huán)組成。體循環(huán)回心靜脈血經(jīng)右心房、右心室、肺動脈及其分支達肺毛細血管進行氣體交換，靜脈血氧合成動脈血經(jīng)肺靜脈再次進入體循環(huán)。肺動脈的結構和功能與體動脈不同，具有管壁薄，橫切面積大，平滑肌細胞數(shù)量少，順應性高，高灌低阻等特點，能夠較好的緩沖右心室射血量改變引起的肺動脈壓波動[1]。在一些病理狀態(tài)如肺動脈高壓(Pulmonary artery hypertension，PAH)、肺栓塞等導致肺循環(huán)障礙，肺動脈壓改變是重要臨床表現(xiàn)和診斷依據(jù)[2]。大鼠是研究肺循環(huán)障礙有關疾病的常用動物，但準確測量大鼠的肺動脈壓較為困難。目前，采用導管測量肺動脈壓是最為常用的方法[3-4]，章新華等[5]對該方法進行了較為詳細的介紹，但一些關鍵技術如導管末端的彎曲程度、壓力曲線變化等缺乏直觀的圖解，以致眾多科研人員無法掌握該方法。為此，本文以野百合堿(Monocrotaline，MCT)誘導的大鼠PAH模型為例詳細介紹中央靜脈導管測量大鼠肺動脈壓的方法，供同行參考。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及主要儀器設備 SD大鼠12只，♂，體重 200～250 g，SPF 級，購自中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK( 渝)2012-0005]， SPF實驗動物房飼養(yǎng)[實驗動物使用許可證號：SYXK( 黔) : 2014-003]，自由進食進水。MCT購于美國Sigma公司。PowerLab八導生理記錄儀(澳大利亞ADInstrument 公司)，顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus 公司)。中央靜脈導管(Secalon，16 G/1.6×40cm，英國Viggo公司產(chǎn)品)。2把眼科彎平臺鑷。

1.2 動物分組及PAH模型復制 將大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為對照組和PAH組，每組6只。對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，PAH組單次皮下注射MCT ( 50 mg/kg) 制備PAH 模型，4周后測量肺動脈壓，mPAP>25 mmHg者視為造模成功。

1.3 PAP測量方法

1.3.1 材料改制方法 中央靜脈導管塑形：如圖1A，將中央靜脈導管末端套入曲別針，注意彎曲長度，浸入約60 ℃溫水中約10 min，自然冷卻后拔出曲別針，并在導管上標記刻度(見圖1B)。6號注射針頭改裝：距針頭末端2～3 mm處彎曲成直角，針頭末端斜面與彎曲平面一致(見圖1C)，改裝針頭用于頸外靜脈插管處開孔。

圖1 中央靜脈導管和6號注射針頭改造示意圖

1.3.2 設備連接與調試 PowerLab八導生理記錄儀經(jīng)壓力換能器與中央靜脈導管連接，定標，并采用袖帶式血壓計校驗壓力信號的準確性。實驗中須固定中央靜脈導管末端與壓力換能器的垂直高度差。

1.3.3 分離頸外靜脈 大鼠術前禁食過夜，腹腔注射10%水合氯醛(2 mL/kg)進行麻醉。仰臥位固定，右側鎖骨上緣延鎖骨中線作約1.5 cm切口，延鎖骨中線分離皮下組織，暴露并分離頸外靜脈至鎖骨上緣，穿線備用(見圖2)。

圖2 大鼠頸靜脈解剖結構、插管手術切口示意圖

1.3.4 插管 使用止血鉗向大鼠頭端牽引備用線，使頸外靜脈處于輕微拉伸狀態(tài)，左手持眼科彎鑷牽拉頸外靜脈遠心端，右手持6號注射針頭于鎖骨上緣0.5 cm頸外靜脈膨大處刺破血管壁，并向近心端拉扯刺破點以擴大血管破損口，然后左手所持眼科彎鑷伸入破損口替換注射針頭，張開眼科彎鑷雙臂，右手持另一把眼科彎鑷夾持中央靜脈導管末端并將其送入頸外靜脈。隨后，導管弓背向腹側、末端指向背側沿頸外靜脈向近心端推進以跨過鎖骨，然后將導管順時針旋轉90°，導管末端向左繼續(xù)推進約2 cm進入右心房并接近右房室口，此時緩慢推進導管，輕微調整導管末端方向，進入右心室。保持導管方向不變，輕微推進即可進入肺動脈。根據(jù)壓力曲線變化判斷導管位置。

1.3.5 評價右心室肥厚、肺動脈重構情況 PAP測量完成后放血處死大鼠，分離心臟， 剪去心耳及血管，完整剝離右心室壁，分別對右心室壁和剩余部分即左心室+室間隔稱重， 根據(jù)公式“右心室壁質量/(左心室質量+室間隔質量)”計算右心室肥厚指數(shù)(Right ventricular hypertrophy index，RVHI)。取肺組織石蠟包埋、切片、H&E 染色，觀察肺血管形態(tài)學變化，測定血管截面積和血管腔截面積， 計算“(血管截面積-血管腔截面積)/血管截面積×100%”， 即血管壁面積占總面積的百分比(WA%)。

2 結果

2.1 導管位置與壓力曲線的對應關系 壓力曲線變化是判斷導管位置的關鍵依據(jù)。如圖3所示，當導管末端到達右心房時壓力曲線波動幅度小，壓力較低。隨后導管弓背向右，末端向左緩慢推進，當導管進入右心室時壓力曲線波動幅度增大，壓力增高。此時，保持導管方向和角度不變，繼續(xù)輕微緩慢推進導管進入肺動脈，壓力曲線波動幅度降低，收縮壓與右心室收縮壓相當，但高于右心房壓。可見，右心房、右心室和肺動脈的收縮壓、舒張壓和脈壓差區(qū)別明顯，根據(jù)各部位壓力曲線特征確定導管末端位置是可靠的。

圖3 導管位置與壓力曲線的對應關系

2.2 MCT-PAH模型肺動脈壓變化 在PAH組，6只大鼠平均肺動脈壓均大于25 mmHg，成模率為100%。如圖4，對照組肺動脈收縮壓16.6 mmHg，舒張壓2.5 mmHg，平均壓10.2 mmHg。PAH組肺動脈收縮壓46.8 mmHg，舒張壓16.5 mmHg，平均壓29.2 mmHg，均顯著高于對照組。

*：與對照組比較， P< 0.05。圖4 MCT-PAH模型肺動脈壓變化

2.3 MCT-PAH模型肺動脈重構、RVHI變化 MCT-PAH模型肺動脈管壁肥厚、管腔狹窄，重構明顯，量化分析顯示PAH組WA%顯著高于對照組(見圖5A)。肺動脈壓增高導致右心室壓力型肥厚，如圖5B所示，PAH組RVHI顯著增高(P< 0.05)。

*：與對照組比較，圖5 MCT-PAH模型肺動脈重構、RVHI變化

2.4 mPAP與WA(%)、RVHI相關性分析 如表1所示，在MCT-PAH模型中，mPAP與WA及RVHI的變化成顯著正相關。

表1 mPAP與WA及RVHI相關性分析

變量mPAPrPWA(%) 0.7400.021RVHI0.930<0.001

3 討論

肺動脈高壓是由多種已知或未知原因引起的肺動脈壓異常升高的一種病理生理狀態(tài)，血流動力學診斷標準為：在海平面、靜息狀態(tài)下，右心導管測量mPAP≥25 mmHg。多普勒超聲心動圖估測肺動脈收縮壓、右心導管測定平均肺動脈壓是診斷肺動脈高壓的主要檢測方法，后者是診斷肺動脈高壓的金標準[6]。

MCT-PAH大鼠模型具有操作簡單、成?？臁⒊赡Ｂ矢?、不需特殊設備等優(yōu)點，是研究肺動脈高壓常用的疾病模型[7]。同樣，測定該模型的mPAP是評價模型是否復制成功的金指標。受大鼠體型的影響，測量MCT-PAH模型大鼠的mPAP較為困難，常用的測量主要可分為間接測量法、估測法和直接測量法。間接測量法即以右心室壓反應肺動脈壓，操作方法包括開胸后直接將導管置入右心室或經(jīng)頸外靜脈、右心房將導管置于右心室兩種方式，右心室壓受回心血量、射血后心室剩余血量、右心室收縮力和右心室后負荷及肺動脈壓等多種因素影響，右心室壓與肺動脈壓存在較大差異[8-9]。估測法是通過超聲心動圖和多普勒超聲估測三尖瓣峰值流速或肺動脈收縮壓[10-11]，是臨床篩查肺動脈高壓最重要的無創(chuàng)性檢測方法，但多數(shù)科研實驗室不具備所需的專業(yè)設備和技術。直接測量法即本文介紹的方法，該方法測量結果準確，但操作技術難度較大。

本文介紹的方法須注意以下若干要點：① 導管的選擇和改造。中央靜脈導管(16 G/1.6×400 mm)的管徑、柔軟程度最為理想，而且易塑形，常溫下不易變形。② 頸外靜脈切口。頸外靜脈切口應位于鎖骨上緣約0.5 cm處，此處頸外靜脈管徑較粗，易于導管進入。③ 導管進入的長度和末端方向是操作成功的關鍵。導管進入頸外靜脈后首先需跨過鎖骨，導管應弓背向腹側、末端指向背側向近心端推進。隨后將導管順時針旋轉90°，導管末端水平向左繼續(xù)推進即可進入右心房。導管通過右房室孔進入右心室較為困難，不同體重的大鼠，鎖骨距離右房室孔的距離略有差異，200 g體重的大鼠約為2 cm，根據(jù)導管刻度判斷，并始終保持導管末端水平向左，緩慢推進導管并輕微旋轉導管，以進入右心室。導管經(jīng)右心室進入肺動脈更需精細操作，保持導管弓背向尾端，末端彎向頭端，輕微推進即可進入肺動脈，導管推進中管口易貼壁，出現(xiàn)壓力較高、波動小甚至無波動曲線，須與肺動脈壓力曲線加以區(qū)別。④ 導管的確切位置需根據(jù)各位置壓力曲線判斷。

MCT-PAH模型肺微小動脈重構是mPAP進行性增高的原因，mPAP增高導致右心室壓力負荷性肥厚，三者為因果關系，變化趨勢可以相互印證。本實驗發(fā)現(xiàn)MCT-PAH模型肺微小動脈重構明顯，mPAP和RVHI顯著增高，而且WA、RVHI與mPAP改變呈顯著正相關，表明本文介紹的肺動脈壓測量方法結果是準確的。