人乳腺癌原代細(xì)胞組織塊培養(yǎng)方法的改良及其鑒定

王 敏，陸 祥，曾 峰，檀 軍，侯澤宇，陳 偉

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 組織胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；3.遵義醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563099)

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)乳腺癌約167.1萬人，年死亡人數(shù)約52.2萬計(jì)[1]。乳腺癌是五大常見癌癥其中之一，也是全球女性最常見的癌癥死亡原因[2-4]。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確[5]，治療方法盡管不盡相同，但結(jié)果卻大同小異，依然呈現(xiàn)出高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移和高死亡率等特點(diǎn)[6]。所以，建立體外的原代人乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)模型，用于人乳腺癌細(xì)胞分子生物學(xué)特征的研究，其重要性日顯突出。研究表明，原代培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞的常見方法包括組織塊貼壁法、酶消化法和細(xì)胞培養(yǎng)法，與酶消化法和細(xì)胞培養(yǎng)法相比較，組織塊貼壁法實(shí)驗(yàn)成本更低廉，細(xì)胞存活率更高[7]。但其在實(shí)際應(yīng)用中也存在自身的缺點(diǎn)，如易污染，在剪碎組織培養(yǎng)細(xì)胞過程中，易造成組織損傷及失活，不利于細(xì)胞爬出，耗時較長等，尤其是成纖維細(xì)胞的生存和適應(yīng)能力強(qiáng)，較早于腫瘤細(xì)胞從組織塊中爬出，進(jìn)一步包繞組織塊導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞難以爬出，少量癌細(xì)胞爬出后也很難完全去除成纖維細(xì)胞，純化方法不易操作而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗[8]。針對這些問題，本研究采用改良的組織塊培養(yǎng)方法將乳腺癌組織塊中的癌細(xì)胞分離、純化、進(jìn)行體外培養(yǎng)，期望在體外培養(yǎng)高純度的原代人乳腺癌細(xì)胞，為后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 人乳腺癌組織標(biāo)本來源 收集2017年6月至2019年4月遵義醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲乳外科10例乳腺癌患者的新鮮癌組織標(biāo)本。在無菌條件下，切取癌組織標(biāo)本約1cm×1cm×1cm大小，放入無菌裝有平衡鹽的離心管中，在冰桶中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。術(shù)后經(jīng)病理診斷均為乳腺導(dǎo)管原位癌，患者年齡在28～56歲，術(shù)前均未進(jìn)行放化療，本研究征得患者或家屬知情同意，符合倫理學(xué)規(guī)范。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；胎牛血清(Hyclone，美國)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma，美國)；CA153兔抗人多克隆抗體(proteintech group，美國)；現(xiàn)配0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美國)；Asinvert200倒置顯微鏡(Nikon，日本)；流式細(xì)胞儀(BD，美國)。

1.2 方法

1.2.1 分組培養(yǎng)人乳腺癌原代細(xì)胞 ①在超凈工作臺內(nèi)，用4℃預(yù)冷的PBS沖洗組織塊，洗凈組織塊上的血跡，并用眼科剪去除壞死組織和脂肪組織；②將乳腺癌組織塊平均分成0.5cm×1cm×1cm大小的兩份，隨機(jī)標(biāo)記為改良組和傳統(tǒng)組；③在含有20%胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)皿中用眼科剪剪成約0.5～2 mm3的碎片；④組織碎片鋪在培養(yǎng)瓶里，每個組織間距為0.3 cm；⑤改良組加少量含20%胎牛血清的DMEM在培養(yǎng)瓶中，不沒過組織塊為準(zhǔn)(25 cm2培養(yǎng)瓶約放1.5 mL培養(yǎng)液)，正置在孵箱中培養(yǎng)；傳統(tǒng)組加少量純胎牛血清濕潤瓶壁后，再放入剪碎的組織塊，倒置培養(yǎng)瓶在孵箱1～2 h后，再正置培養(yǎng)瓶，沿培養(yǎng)瓶邊緩慢加入適量的含20%胎牛血清的DMEM，放置于37℃恒溫，CO2濃度為5%，濕度為95%的孵箱中培養(yǎng)[15]；⑥隔日換液，觀察人乳腺癌原代細(xì)胞爬出時間、爬出數(shù)量及貼壁生長情況。

1.2.2 組織塊培養(yǎng)7d后貼壁細(xì)胞總量計(jì)數(shù) 組織塊培養(yǎng)7d后，在超凈臺中，轉(zhuǎn)移組織塊至其他培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，用0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，至貼壁細(xì)胞完全脫落，重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，倒置相差顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每毫升細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次。細(xì)胞總量=每毫升細(xì)胞數(shù)×細(xì)胞懸液的體積。

1.2.3 純化人乳腺癌原代細(xì)胞 改良組貼壁人乳腺癌原代細(xì)胞鋪滿瓶底50%左右時，用延長胰酶消化時間差法一次性純化原代細(xì)胞，方法：用0.25%胰酶處理貼壁細(xì)胞5～6 min，當(dāng)長梭形的成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中完全消化脫落，而不規(guī)則形的人乳腺癌原代細(xì)胞仍然附著在培養(yǎng)瓶上時，輕輕吸出瓶內(nèi)胰酶并用PBS沖洗，然后再用0.25%胰酶消化人乳腺癌原代細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；傳統(tǒng)組貼壁人乳腺癌原代細(xì)胞鋪滿瓶底80%～100%時，用反復(fù)酶消化時間差法純化原代細(xì)胞，方法：用0.25%胰酶處理貼壁細(xì)胞2～4 min，先消化一部分成纖維細(xì)胞后，再重復(fù)上述操作，直致去除成纖維細(xì)胞，然后再用0.25%胰酶消化人乳腺癌原代細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)[15]。

1.2.4 免疫組化鑒定兩組人乳腺癌原代細(xì)胞 通過人乳腺癌特異性分子CA153[10]的陽性表達(dá)鑒定原代細(xì)胞，方法如下：①利用所培養(yǎng)的兩組人乳腺癌原代細(xì)胞制作爬片，取出后，PBS洗3遍，每次3分鐘。4℃冷丙酮固定10 min，干燥30 min。② 用PBS洗3次，每次5min，加3%過氧化氫30μL，室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS洗3次，每次5min。③加1%的Triton X-100 30μL，室溫孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS洗3次，每次5min。④滴山羊血清30μL，室溫孵育30 min，傾去勿洗。⑤滴加稀釋后(1∶100)兔抗人多克隆CA153一抗抗體，空白對照組以PBS代替一抗，4℃濕盒孵育過夜。PBS洗3次，每次5min。⑥滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液30μL，室溫孵育30 min。PBS洗3次，每次5min。⑦滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素30μL，室溫孵育30 min。PBS洗3次，每次5min。⑧滴加DAB顯色劑30μL，顯微鏡下觀察顯色，自來水沖洗。⑨蘇木精染液染色2 min，自來水洗，迅速過鹽酸酒精溶液，自來水洗，過氨水溶液，自來水洗。⑩梯度酒精脫水。二甲苯透明。中性樹膠封片，明場拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)比較兩組人乳腺癌原代細(xì)胞純度 原代細(xì)胞用0.25%胰酶消化后取約1×106個細(xì)胞用4%多聚甲醛過夜固定，PBS洗滌2次后，傳統(tǒng)組和改良組分別加入兔抗人CA153[10]抗體(1∶100)室溫孵育45 min 。PBS洗滌2次后分別加入熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1:50)4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞，采用美國BD公司流式細(xì)胞儀 (Flow Cytometry)進(jìn)行檢測。

1.2.6 純化后細(xì)胞貼壁生長觀察及細(xì)胞活性檢測 倒置顯微鏡下分別觀察純化1、2、3d后人乳腺癌原代細(xì)胞的生長情況。在細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，去除培養(yǎng)液，每孔加入20μL的MTT溶液，孵育4 h后，每孔加入150 μL的DMSO溶液，振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測得570 nm處吸光度值(OD值)。取3個孔的均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組原代細(xì)胞爬出時間、爬出數(shù)量及貼壁生長情況 改良組和傳統(tǒng)組組織塊貼壁1d后，有活性的乳腺癌組織塊均能緊密貼壁，倒置顯微鏡下觀察，組織塊透光性差，呈現(xiàn)為暗黑色遮光區(qū)域(見圖1紅色箭頭)；改良組培養(yǎng)1d后見周圍有大量單個細(xì)胞游出，圓形、體積小、折光性強(qiáng)(見圖1～a1黑色箭頭)，3d后見部分細(xì)胞散在貼壁，5d后見大部分細(xì)胞貼壁生長，貼壁細(xì)胞胞核較大，核明顯，融合生長，相互銜接呈典型的“鋪路石”狀，鋪滿瓶底50%左右(見圖1-a5黑色箭頭)，培養(yǎng)7d貼壁細(xì)胞融合成一片(見圖1-a7)；而傳統(tǒng)組1d后見少量單個圓形細(xì)胞爬出(見圖1-b1黑色箭頭)，5d后見部分細(xì)胞貼壁(見圖1-b5黑色箭頭)，培養(yǎng)7d后，部分原代細(xì)胞融合生長，僅鋪滿瓶底30%左右(見圖1-b7)，見圖1。

a1～a8：分別代表改良組培養(yǎng)1～8d； b1～b8：分別代表傳統(tǒng)組培養(yǎng)1～8d；紅色箭頭：貼壁組織塊，黑色箭頭：原代細(xì)胞。圖1 兩組原代細(xì)胞爬出時間、爬出數(shù)量及貼壁生長情況(×100)

2.2 組織塊培養(yǎng)7d后貼壁細(xì)胞總量 組織塊培養(yǎng)7d后，改良組織塊培養(yǎng)法明顯比傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法獲得的貼壁細(xì)胞數(shù)多。改良組所得貼壁細(xì)胞總數(shù)約為(9.88±0.20)×105個，而傳統(tǒng)組所得貼壁細(xì)胞總數(shù)約為(4.88±0.21)×105個，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見圖2)。

**：與傳統(tǒng)組比較，P<0.001；n=3。圖2 組織塊培養(yǎng)7d后獲得的貼壁細(xì)胞總量

2.3 人乳腺癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定 人乳腺癌原代細(xì)胞純化后經(jīng)CA153染色，顯微鏡下可見兩組原代培養(yǎng)細(xì)胞胞核和胞漿染成棕色，證實(shí)細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞(CA153蛋白)。非乳腺癌細(xì)胞胞核和胞漿未被染成棕色，傳統(tǒng)組見少許未被染色細(xì)胞(見圖3)。

2.4 兩組人乳腺癌原代細(xì)胞純度比較 改良組原代人乳腺癌細(xì)胞特異性抗體CA153陽性表達(dá)率(99.13±0.06)%，明顯高于傳統(tǒng)組陽性表達(dá)率(75.72±4.96)%。，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

2.5 純化后人乳腺癌原代細(xì)胞貼壁生長情況 倒置顯微鏡下觀察，改良組純化1d后乳腺癌原代細(xì)胞可鋪滿瓶底50%左右，細(xì)胞胞質(zhì)展開，體積大小不一，融合成片貼壁生長，細(xì)胞折光性好，2d后，原代細(xì)胞融合成片相互銜接后呈典型的“鋪路石”狀，鋪滿瓶底80%，3d后細(xì)胞結(jié)合緊密,生長分裂旺盛；而傳統(tǒng)組純化1d后細(xì)胞僅鋪滿瓶底20%左右，仍可見梭形的成纖維細(xì)胞貼壁，2d后，細(xì)胞鋪滿瓶底30%左右，3d后，貼壁細(xì)胞融合成片，鋪滿瓶底約60%，鏡下可見梭形成纖維細(xì)胞貼壁生長(見圖6)。

黑色箭頭：人乳腺癌原代細(xì)胞；紅色箭頭：非人乳腺癌原代細(xì)胞(a1、b1×100，a2、a3、b2、b3×400)。圖3 人乳腺癌原代細(xì)胞CA153陽性表達(dá)

圖4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定、比較人乳腺癌原代細(xì)胞純度

2.6 純化48h后貼壁人乳腺癌原代細(xì)胞的活性 兩種方法獲得純化48h后貼壁原代細(xì)胞的活性，通過吸光度值OD代表。傳統(tǒng)組細(xì)胞OD值為(0.47±0.01)，改良組OD值為(0.86±0.03)，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見圖7)。

*：與傳統(tǒng)組比較，P<0.05；n=3。圖5 流式細(xì)胞術(shù)比較兩組人乳腺癌原代細(xì)胞純度

a：改良組，b：傳統(tǒng)組。圖6 純化后人乳腺癌原代細(xì)胞貼壁生長情況(×100)

**:與傳統(tǒng)組比較，P<0.001；n=3。圖7 純化48h后貼壁人乳腺癌原代細(xì)胞的活性

3 討論

人乳腺癌原代細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法是從乳腺癌患者癌組織中分離人乳腺癌原代細(xì)胞，生物學(xué)特性變化不大，最大程度保留原來的遺傳特性，也最接近其在體內(nèi)的生長特性，適宜做各種實(shí)驗(yàn)研究[11]。常用培養(yǎng)原代細(xì)胞的方法有酶消化法、細(xì)胞培養(yǎng)法和組織塊貼壁法，因酶消化培養(yǎng)法的消化時間不易控制，易導(dǎo)致培養(yǎng)失敗[12]，而有學(xué)者對細(xì)胞培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法比較，結(jié)果組織塊培養(yǎng)法的成功率為90.0%，細(xì)胞培養(yǎng)法的成功率為20.0%[13]。從而得出結(jié)論，組織塊培養(yǎng)法是較好最常用的原代培養(yǎng)方法。但其在實(shí)際應(yīng)用中也存在著本身的缺點(diǎn)，成纖維細(xì)胞難以去除，培養(yǎng)時間長等缺點(diǎn)[14]。針對這些問題，本研究采用改良的組織塊培養(yǎng)和純化方法，將乳腺癌組織塊中的癌細(xì)胞分離、純化、進(jìn)行體外培養(yǎng)，成功在體外培養(yǎng)了高純度的原代人乳腺癌細(xì)胞。

傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)方法中，將剪碎的組織塊倒置放入孵箱1～2h后，再行常規(guī)培養(yǎng)，這種操作，雖然增加了組織塊的貼壁牢固度，但是易造成組織細(xì)胞失活，影響細(xì)胞爬出數(shù)量，最終易導(dǎo)致培養(yǎng)失敗[15]。改良組織塊培養(yǎng)方法，常規(guī)剪碎組織塊后，將剪碎的組織塊放入少量含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)瓶，正置培養(yǎng)瓶于孵箱中4～6h后，觀察組織塊貼壁后，再適當(dāng)?shù)稳霂椎闻囵B(yǎng)液，持續(xù)觀察培養(yǎng)液的量及組織塊貼壁情況。傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)純化原代細(xì)胞中，常規(guī)等原代細(xì)胞鋪滿瓶底>80%時，再用胰酶消化時間差法純化原代細(xì)胞，然而此時成纖維細(xì)胞易老化，不易被消化，用反復(fù)胰酶消化時間差法，仍不能達(dá)到純化的目的，不僅會影響細(xì)胞活性，而且因原代人乳腺癌細(xì)胞純度低，成纖維細(xì)胞生長迅速而抑制原代乳腺癌細(xì)胞生長，導(dǎo)致不能獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)，所以改良后的純化方法是原代細(xì)胞鋪至50%左右時，即用胰酶消化時間差法一次性純化原代乳腺癌細(xì)胞，降低純化難度的同時，細(xì)胞活性好，不僅減少了反復(fù)胰酶消化降低細(xì)胞活性，并且減少了細(xì)胞污染的概率，高效快速獲得高純度乳腺癌細(xì)胞。

在實(shí)驗(yàn)過程中，經(jīng)過多次探索發(fā)現(xiàn)有以下幾點(diǎn)需要注意：①取材：盡量在癌組織豐富的區(qū)域取材，放入含有轉(zhuǎn)運(yùn)液的無菌離心管中，在冰桶中帶回實(shí)驗(yàn)室，盡快開始實(shí)驗(yàn)，間隔時間應(yīng)不超過4 h；②剪切：剪切過程要在冰袋上完成，降低細(xì)胞代謝，盡可能的去除脂肪組織和血跡，剪碎組織時間應(yīng)控制在10 min內(nèi)；③使用改良組織塊培養(yǎng)法，正置培養(yǎng)瓶在孵箱中培養(yǎng)時，培養(yǎng)液一定不能沒過組織塊，組織塊貼壁才能確保細(xì)胞能從組織塊中爬出，隔天換液一次，原代細(xì)胞鋪滿瓶底50%時，進(jìn)行純化；④24 h后換液，未貼壁的原代細(xì)胞仍有貼壁的可能，可以收集繼續(xù)培養(yǎng)；⑤純化后如細(xì)胞量不多，可放在12孔板中培養(yǎng)，傳代后再放入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

綜上所述，本文所介紹的改良組織塊培養(yǎng)法可以獲得活力好、純度高的人原代乳腺癌細(xì)胞，且培養(yǎng)純化時間明顯縮短，是一種較好的培養(yǎng)人乳腺癌原代細(xì)胞的方法，為后期乳腺癌原代細(xì)胞的研究建立了良好的基礎(chǔ)。