大黃素對(duì)布魯菌感染 BALB/c 小鼠模型的治療作用

周小仙，朱 珠，陳澤慧，陳安林，楊智芳

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563003；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563006)

布魯菌是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，人體感染后可引起復(fù)發(fā)性發(fā)熱和流感樣癥狀，并導(dǎo)致多器官受累，家畜感染后可引起流產(chǎn)和不孕。布魯菌作為胞內(nèi)寄生的隱匿性病原體，對(duì)宿主免疫機(jī)制具有調(diào)節(jié)作用。布魯菌感染后，宿主中性粒細(xì)胞幾乎不能被激活，導(dǎo)致其能通過(guò)抵抗吞噬細(xì)胞殺傷機(jī)制而逃避天然免疫系統(tǒng)和特異性免疫系統(tǒng)的清除作用[1-3]。大部分抗菌藥物不能滲透巨噬細(xì)胞膜而發(fā)揮抗菌作用，以上這些因素均可能導(dǎo)致布魯菌感染治療失敗率高、復(fù)發(fā)率高、周期長(zhǎng)、副作用大[3]，甚至已有強(qiáng)力霉素耐藥和利福平耐藥的布魯菌出現(xiàn)[4]。因此，尋找一種安全有效、毒副作用小且能夠透過(guò)細(xì)胞膜而用于治療布魯菌病的藥物具有十分重要的意義。大黃素是一種蒽醌類化合物，具有水溶性差、脂溶性好的特點(diǎn)[5]，對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等病原菌具有一定的抑菌作用[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可通過(guò)增加IL-6、TNF-α 和IFN-γ 的表達(dá)量，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)布魯菌的殺傷能力[7]。為了進(jìn)一步證實(shí)其療效，本課題組通過(guò)構(gòu)建布魯菌感染BALB/c小鼠模型以觀察大黃素對(duì)布魯菌感染小鼠的治療效果，以期為大黃素抗布魯菌感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c 小鼠，雌雄各半，SPF級(jí)6～8周，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重18～20 g。

1.2 試劑 大黃素(純度 ≥ 99.0%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胰蛋白胨大豆瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯平板購(gòu)自青島高科園海博生物科技有限公司；基因組DNA 提取試劑盒及PCR 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自上海生工生物公司；Mueller-Hinton Broth 肉湯購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司；試管凝集試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自北京賽諾利康生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器設(shè)備 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及比濁儀為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；T100TMThermal Cycler PCR 擴(kuò)增儀為德國(guó)BIO RAD 公司產(chǎn)品；DYCP-31DN 型電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品；FA1104B 電子天平為美國(guó)奧豪斯公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)菌株分離培養(yǎng)鑒定 采用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)臨床分離菌株進(jìn)行初步鑒定，16S rDNA 分子技術(shù)對(duì)該菌株再次進(jìn)行菌種鑒定，16S rDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的引物序列為：27 F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1492 R: 5'-TACGYTACCTTGTTACGACTT-3'。

1.4.2 構(gòu)建布魯菌感染小鼠模型 70 只BALB/c 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(1×102、1×103、1×104、1×105、1×106和1×107CFU/mL菌液)，每組10 只，雌雄各半。對(duì)照組，每只小鼠腹腔注射200 μL PBS 溶液，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射200 μL按照上述分組設(shè)定的菌液構(gòu)建小鼠感染模型[8]。注射菌液后第1周和第2周脫頸處死小鼠，進(jìn)行血清試管凝集試驗(yàn)(Serum tube agglutination test,SAT)和脾臟載菌量檢測(cè)(取脾臟研碎稀釋后接種于平板上，觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)，并采用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀和16S rDNA分子技術(shù)對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定)，確定成功構(gòu)建布魯菌感染小鼠模型的菌液濃度及時(shí)間。

1.4.3 布魯菌感染小鼠不同時(shí)間對(duì)肝脾的影響 將40 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組20 只，雌雄各半。對(duì)照組每只腹腔注射200 μL 生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組注射上述成功構(gòu)建小鼠感染模型濃度的布魯菌液200 μL。分別于1、2、4、6周時(shí)脫頸處死小鼠，取出肝脾組織，稱量肝脾濕重后，計(jì)算肝脾指數(shù)(指數(shù)=臟器濕重/小鼠體重×100 %)，HE 染色觀察肝脾組織病理變化。

1.4.4 大黃素對(duì)布魯菌感染小鼠的治療效果 將50 只布魯菌感染小鼠隨機(jī)分為磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer solution,PBS) 組、多西環(huán)素組和大黃素組(2、4、8 mg/mL)，每組10 只，雌雄各半。第1周每只小鼠每天用1 mL相應(yīng)藥物灌胃1次，第2～3周每3 d灌胃1次。最后一次灌胃結(jié)束1 d脫頸處死小鼠，通過(guò)體重稱量、腹腔積液菌落計(jì)數(shù)、肝脾指數(shù)測(cè)量及肝脾組織HE 染色觀察病理變化。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)菌株鑒定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀GN 鑒定卡鑒定該菌株為羊布魯菌 ，生物編碼為0000001300001001，置信度99% 。16S rDNA分子技術(shù)鑒定結(jié)果中，PCR擴(kuò)增該菌的目的基因片段長(zhǎng)度為1 500 bp(見(jiàn)圖1)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，并將此PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得序列(見(jiàn)圖2)經(jīng)Blast 對(duì)比分析，其與羊布魯同源性為97%(見(jiàn)圖3)。

Sam1、Sam2和 Sam3為重復(fù)實(shí)驗(yàn)菌株。 圖1 實(shí)驗(yàn)菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 實(shí)驗(yàn)菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

圖3 實(shí)驗(yàn)菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列比對(duì)結(jié)果

2.2 成功構(gòu)建布魯菌感染小鼠模型菌液濃度 以1×105CFU/mL菌液腹腔注射小鼠2周時(shí)，出現(xiàn)SAT(++)、脾臟載菌(+)，由此判定小鼠感染布魯菌的菌液濃度可能為1×105CFU/mL(見(jiàn)表1)。細(xì)菌學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，1×105CFU/mL菌液腹腔注射小鼠2周后在脾臟組織中檢出羊布魯菌，而對(duì)照組無(wú)細(xì)菌檢出，表明通過(guò)腹腔注射1×105CFU/mL菌液2周可成功構(gòu)建布魯菌感染小鼠模型。

2.3 布魯菌感染小鼠不同時(shí)間對(duì)肝脾指數(shù)的影響 布魯菌感染小鼠2周后開(kāi)始出現(xiàn)肝脾指數(shù)增加，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，增加越明顯。1、2、4、6周時(shí)，對(duì)照組的肝臟指數(shù)分別為5.835±0.626、5.665±0.131、6.258±0.621和6.410±0.993，實(shí)驗(yàn)組肝臟指數(shù)分別為6.002±0.459、7.157±0.203、8.429±0.954和8.305±0.756；1、2、4、6周時(shí)，對(duì)照組的脾臟指數(shù)分別為0.478±0.033、0.494±0.043、0.537±0.111和0.478±0.047，實(shí)驗(yàn)組脾臟指數(shù)分別為0.547±0.061、0.752±0.070、1.083±0.197和1.931±0.236(見(jiàn)圖4)。

表1不同濃度的布魯菌液感染小鼠不同時(shí)間SAT和脾臟載菌情況

組別1周SAT脾臟載菌量2周SAT脾臟載菌量對(duì)照組----1×102 CFU/mL-+-+1×103 CFU/mL-+-+1×104 CFU/mL-+-+1×105 CFU/mL-++++1×106 CFU/mL-++++1×107 CFU/mL-++++

SAT“++”及以上血清稀釋度判斷為該血清抗體陽(yáng)性。

a: 與相應(yīng)時(shí)間的對(duì)照組比，P <0.05；b: 與第1周的實(shí)驗(yàn)組比，P <005；c: 與第1周的實(shí)驗(yàn)組比，P <0.01。圖4 布魯菌感染小鼠不同時(shí)間對(duì)肝脾指數(shù)的影響

2.4 布魯菌感染小鼠的肝脾組織病理變化 實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，細(xì)胞間隙增寬，胞漿發(fā)生脂肪樣變性，細(xì)胞核固縮；脾臟結(jié)構(gòu)紊亂，脾小體、脾小粱基本不可見(jiàn)，紅、白髓分界不明，白髓區(qū)明顯減少，其間出現(xiàn)纖維樣改變(見(jiàn)圖5)。

以上病理組織切片均采自布魯菌感染小鼠4周的組織病理切片，其中肝臟組織病理切片中，★為中央靜脈，▲和↖均為肝細(xì)胞。脾臟組織病理切片中★和☆均為白髓，▲和△均為紅髓，○為中央動(dòng)脈，↖為脾小粱。圖5 布魯菌感染小鼠肝脾組織的病理變化

2.5 大黃素對(duì)布魯菌感染小鼠體重和腹腔載菌量的影響 與PBS 組相比，大黃素組(2、4、8 mg/mL)和多西環(huán)素組小鼠腹腔細(xì)菌量明顯減少(P<0.05)，體重明顯增加(P<0.05)，且8 mg/mL大黃素組和多西環(huán)素組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)。PBS組、多西環(huán)素組和大黃素組(2、4、8 mg/mL)的腹腔載菌量(lg CFU值)分別為5.161±0.501、4.003±0.093、5.175±0.361、4.771±0.498和4.023±0.199；PBS組、多西環(huán)素組和大黃素組(2、4、8 mg/mL)的體重分別為(18.047±0.418)g、(18.921±0.291)g、(19.043±0.252)g、(18.816±0.445)g和(19.008±0.430)g(見(jiàn)圖6)。

a：與PBS組相比，P <0.05； b：與多西環(huán)素組相比，P <0.05。圖6 不同濃度大黃素對(duì)布魯菌感染小鼠體重和腹腔載菌量的影響

2.6 大黃素對(duì)布魯菌感染小鼠肝脾的影響 8 mg/mL大黃素組小鼠肝臟指數(shù)較PBS 組小鼠明顯降低，病理切片見(jiàn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等各種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肝細(xì)胞排列緊密而規(guī)則，分界清楚，未見(jiàn)變性和壞死(見(jiàn)表2和圖7)。

大黃素組(2、4、8 mg/mL)和多西環(huán)素組脾臟指數(shù)較PBS組小鼠明顯減低(P<0.05)，且8 mg/mL大黃素組和多西環(huán)素組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，小鼠脾臟組織變化顯示，大黃素組(2、4、8 mg/mL)和多西環(huán)素組均有不同程度改善，結(jié)構(gòu)排列規(guī)則有序，紅白髓分界清楚，脾小體數(shù)量曾多。其中8 mg/mL大黃素組和多西環(huán)素組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)接近正常組小鼠(見(jiàn)圖8和表2)。

表2大黃素對(duì)布魯菌感染小鼠肝脾指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果

組別肝臟指數(shù)脾臟指數(shù)PBS8.913±0.7491.440±0.199多西環(huán)素6.652±0.748a0.554±0.079a2 mg/mL 大黃素8.393±0.635b0.775±0.120ab4 mg/mL 大黃素8.074±0.746b0.598±0.070a8 mg/mL 大黃素7.200±0.466a0.546±0.030a

a： 與PBS組相比，P<0.05；b：與多西環(huán)素組相比，P<0.05。

A：PBS組；B：多西環(huán)素組；C：2 mg/mL大黃素組；D：4 mg/mL大黃素組;E:8 mg/mL大黃素組。圖7 不同濃度大黃素對(duì)布魯菌感染小鼠肝臟組織病理學(xué)變化

A：PBS組；B：多西環(huán)素組；C：2 mg/mL大黃素組；D：4 mg/mL大黃素組;E:8 mg/mL大黃素組。圖8 不同濃度大黃素對(duì)布魯菌感染小鼠脾臟組織病理學(xué)變化

3 討論

布魯菌屬是高致病性病原體，而羊布魯菌又是布魯菌屬中最常見(jiàn)、毒性最強(qiáng)、病情最嚴(yán)重的亞種，人們常通過(guò)接觸被感染牲畜或被污染牲畜產(chǎn)品引起致病，其感染后可在人體肝脾、淋巴結(jié)等器官中生存繁殖，導(dǎo)致全身各個(gè)系統(tǒng)不可逆的損害[2]。臨床上常根據(jù)布魯菌生化反應(yīng)、基因組及蛋白組學(xué)的不同進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定，但因單一鑒定方法容易出現(xiàn)錯(cuò)誤鑒定結(jié)果，最好采用兩種方法同時(shí)進(jìn)行鑒定[9]。本次研究通過(guò)采用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀及16S rDNA基因序列分析兩種方法均鑒定為羊布魯菌，確保了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

布魯菌可經(jīng)呼吸道、消化道和皮膚接觸等多種途徑引起宿主感染，采用肺遞送、滴鼻和腹腔注射3 種方式均可構(gòu)建小鼠感染模型[8,10-11]，此次研究中通過(guò)腹腔注射1x105CFU/mL菌液200 μL成功構(gòu)建小鼠感染模型，結(jié)果與付湘云和韋超等報(bào)道一致，均顯示布魯菌感染的小鼠肝脾組織發(fā)生了病理?yè)p傷[10-11]。布魯菌感染導(dǎo)致肝脾損傷的原因可能是，布魯菌感染機(jī)體后，主要寄生在巨噬細(xì)胞、胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞中，菌體的脂多糖(LPS)、T4SS 分泌系統(tǒng)和BvrR/BvrS 系統(tǒng)等毒力因子可與宿主細(xì)胞表面相互作用，形成含有布魯菌的空泡對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生損傷[12]。宿主感染布魯菌以細(xì)胞免疫為主[13]，參與細(xì)胞免疫的專職抗原提呈細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞[14]。在巨噬細(xì)胞上有較多的布魯菌識(shí)別受體，當(dāng)布魯菌感染宿主后優(yōu)先侵染巨噬細(xì)胞，通過(guò)減少胞內(nèi)TNF-α 的分泌而抑制其凋亡。布魯菌與巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體融合，形成布氏小體，逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視、免疫應(yīng)答和免疫殺傷作用，為自己創(chuàng)造在細(xì)胞內(nèi)生存繁殖的良好生存環(huán)境[15]。肝脾又是巨噬細(xì)胞最豐富的器官，小鼠被布魯菌感染后可能會(huì)造成肝脾損傷。

目前，臨床對(duì)布魯菌感染的治療仍以聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物為主，WHO 推薦多西環(huán)素聯(lián)合利福平6周、多西環(huán)素聯(lián)用強(qiáng)力霉素45 d、多西環(huán)素和鏈霉素聯(lián)用21 d治療布魯菌感染患者[16]。多西環(huán)素、利福平等抗菌藥物長(zhǎng)期服用增加藥物毒副作用，尤其是對(duì)肝臟的損害。近年來(lái)隨著大量抗菌藥物的使用，逐漸出現(xiàn)了利福平、復(fù)方新諾明對(duì)布魯菌耐藥的報(bào)道[4]，所以尋找新的藥物治療布魯菌病已成為研究熱點(diǎn)。大黃素是一種分離自大黃、虎杖、何首烏、蘆薈和決明子等中藥的天然蒽醌類產(chǎn)物，具有抗病毒，抗菌，抗炎，抗過(guò)敏，抗腫瘤，抗骨質(zhì)疏松，治療糖尿病，免疫抑制和保護(hù)神經(jīng)等多種藥理活性[17]。朱珠等[7]研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)布魯菌的殺傷能力。本次研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可減少小鼠腹腔積液中細(xì)菌的量，增加體重，改善肝脾組織的病理?yè)p傷，且8 mg/mL大黃素與多西環(huán)素的治療效果相同。大黃素作為天然植物提取物，與臨床常用的抗生素、激素等相比，在使用時(shí)不易產(chǎn)生耐藥性，可從干擾核糖、蛋白、能量轉(zhuǎn)化、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性等各個(gè)環(huán)節(jié)而抑制布魯菌生長(zhǎng)[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素僅在較高劑量(4 000 mg/kg)作用下才可引起不可逆的病理改變，產(chǎn)生 肝毒性、腎毒性和生殖毒性，低中劑量不會(huì)造成病理改變[20]。而此次研究顯示所需大黃素為8 mg/mL以下就有抗感染效果，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于中毒劑量。因此，臨床上針對(duì)布魯菌感染患者，可選用大黃素輔以治療，減少抗菌藥物的毒副作用及耐藥性。