piRNAs在果蠅中使轉(zhuǎn)座子沉默

陳語(yǔ)

摘 要：轉(zhuǎn)座子（TEs）是可以在基因組內(nèi)移動(dòng)的DNA序列。TEs可以通過(guò)多種機(jī)制大幅度地塑造基因組，轉(zhuǎn)錄本和宿主生物的蛋白組。但是，TEs通常干擾基因并且是宿主基因組不穩(wěn)定，這樣本質(zhì)上降低了宿主生物的適合度。理解TEs的基因組的干擾和進(jìn)化的動(dòng)態(tài)將大大地加深我們對(duì)TE介導(dǎo)的生物過(guò)程的理解。大部分TE插入在黑腹果蠅中是高度多態(tài)的，提供給我們一個(gè)很好的系統(tǒng)在群體水平來(lái)研究TEs的進(jìn)化。數(shù)十年的理論和實(shí)踐的研究已經(jīng)很好的建立起“轉(zhuǎn)座-選擇”群體基因模型，此模型假設(shè)在TE復(fù)制和單純選擇之間的平衡決定TEs在基因組內(nèi)克隆的數(shù)目。在過(guò)去的十年中，P元件誘導(dǎo)的wimpy testis-interacting RNAs（piRNAs）被證明是TE在果蠅中活動(dòng)的主要抑制著。piRNAs的發(fā)現(xiàn)革新了我們對(duì)TE抑制的理解，因?yàn)樗沂玖怂拗魃镆呀?jīng)進(jìn)化出一種適應(yīng)性的機(jī)制來(lái)抵御TE的入侵。大量的項(xiàng)目被實(shí)施來(lái)理解piRNAs抑制活躍的TEs的分子機(jī)制，盡管在此過(guò)程中的許多細(xì)節(jié)仍待進(jìn)一步的探索。piRNAs和TEs之間的相互作用很好的解釋了在果蠅中I-R系統(tǒng)和P-M系統(tǒng)雜種不育的根本分子機(jī)制，這曾困擾進(jìn)化生物學(xué)家數(shù)十年。piRNA抑制通路給我們提供了一個(gè)無(wú)與倫比的系統(tǒng)來(lái)研究寄生物和宿主之間共進(jìn)化的過(guò)程。

關(guān)鍵詞：piRNA；轉(zhuǎn)座子；轉(zhuǎn)座子沉默；“Ping-Pong”循環(huán)

1.介紹

雜種不相容常常導(dǎo)致兩亞種之間的生殖隔離，這對(duì)選育很重要。雜種不相容的經(jīng)典基因機(jī)制是Bateson-Dobzhansky-Muller模型。在此模型下，當(dāng)一個(gè)祖先種群分化成兩個(gè)亞群是，原始的兩個(gè)相互作用的基因，在祖先種群中是aa和bb，在兩個(gè)亞種中分別進(jìn)化成AA和bb，aa和BB。如果配子A和B相互不相容，則兩個(gè)亞種的雜交后代將會(huì)死亡或者不育，導(dǎo)致兩個(gè)亞種的生殖隔離。在眾多導(dǎo)致雜種不育可能的機(jī)制中，一個(gè)重要的形式是外來(lái)基因組沖突。當(dāng)在一個(gè)基因組內(nèi)的基因被不同的機(jī)制傳送輸，或者當(dāng)一個(gè)基因通過(guò)損害宿主增加其傳輸時(shí)，外來(lái)基因沖突興起。然后宿主馬上發(fā)展策略來(lái)抑制這自私的基因元件造成的決定性影響。基因組的沖突常常經(jīng)常導(dǎo)致雜種不相容或者雜種不育。

轉(zhuǎn)座子（TEs）代表了一種在幾乎所有生物基因組內(nèi)的自私元件，而P元件誘導(dǎo)的piRNAs代表sRNAs中的一種，sRNAs在動(dòng)物生殖細(xì)胞中抑制TEs。piRNA通路的發(fā)現(xiàn)很好地解釋了長(zhǎng)久以來(lái)的進(jìn)化上的觀察，比如導(dǎo)致果蠅雜種不育的I-R系統(tǒng)和P-M系統(tǒng)。在此，我們簡(jiǎn)短地總結(jié)在生物基因，機(jī)制和在模式生物果蠅中piRNAs的功能的研究過(guò)程，并且我們討論TEs和piRNAs相互作用可能的進(jìn)化寓意。

2.TEs

TEs的含量在真核生物基因組中變化廣泛，從1%到80%。根據(jù)移動(dòng)的機(jī)制，TEs被分為轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子是在基因組中可移動(dòng)的DNA片段，可以通過(guò)“cut and paste”被轉(zhuǎn)座到另一個(gè)位點(diǎn)，然而反轉(zhuǎn)座子是通過(guò)RNA的反轉(zhuǎn)錄以“copy and paste”的方式來(lái)介導(dǎo)和復(fù)制，以致插入新的位點(diǎn)。TEs可以通過(guò)水平轉(zhuǎn)移在物種間穿行。

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化，TEs通過(guò)大量的機(jī)制形成了宿主基因組的組分。首先，同源TEs的拷貝分散在基因組中可以誘導(dǎo)異位重組。第二，TEs可以被馴化形成編碼蛋白質(zhì)的基因的新結(jié)構(gòu)域。第三，TEs的適應(yīng)擴(kuò)展可以提供新的基序來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。TE插入已經(jīng)被很好的證明是有助于宿主的適應(yīng)性進(jìn)化，通過(guò)影響周圍基因的表達(dá)。盡管TEs很大程度上影響基因組的進(jìn)化，但是它們基本對(duì)宿主有損害，因?yàn)椋?.破壞編碼和基因的調(diào)控區(qū)域；2.減少細(xì)胞的能量和資源；3.通過(guò)異位重組介導(dǎo)細(xì)胞錯(cuò)誤的重排。

TEs在果蠅中已被研究數(shù)十年。大約120TE家族已經(jīng)在D.melanogaster內(nèi)被識(shí)別，這至少占真核生物基因組的5%。在D.melanogaster內(nèi)有約2000未激活的inaction vation escape 1（INE-1）基因家族的拷貝，即使對(duì)于大部分TE家族拷貝的數(shù)目在1到300之間。基于這種表達(dá)的模式，TEs可以被分為生殖細(xì)胞特異，體細(xì)胞和介導(dǎo)群體。大部分在果蠅中的TEs是活躍的，并且在D.melanogaster內(nèi)產(chǎn)生可見(jiàn)表型的突變幾乎50%到80%都是由TEs導(dǎo)致。估計(jì)TEs降低了大約0.4%到5%的果蠅適合度。

3.Argonaute蛋白

自從RNA干擾（RNAi）機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，sRNAs的全部?jī)?nèi)容正在被探究。Argonaute（AGO）蛋白結(jié)合sRNAs并且形成RNA誘導(dǎo)的復(fù)合物（RISC），在RISC中sRNAs識(shí)別帶有互補(bǔ)序列的目標(biāo)基因，AGO蛋白剪切和抑制目標(biāo)基因。AGO由四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N末端結(jié)構(gòu)域，PAZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合RNAs，MID結(jié)構(gòu)域結(jié)合mRNA的Cap結(jié)構(gòu)，PIWI結(jié)構(gòu)域?qū)δ繕?biāo)基因的剪切至關(guān)重要。AGO蛋白很古老并且可以在幾乎所有真核生物中找到，除了Saccharomyces cerevisiae。AGO家族的大小在不同物種中不同，在哺乳動(dòng)物中有八個(gè)基因，果蠅中五個(gè)，線蟲(chóng)中27個(gè)。AGO蛋白質(zhì)被分成三個(gè)分支：AGO，PIWI和線蟲(chóng)特異的AGO（WAGO）分支。微RNAs（miRNAs）和小干擾RNAs（siRNAs）都可以與AGO蛋白結(jié)合并且參與在細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程，而PIWI蛋白主要在生殖腺表達(dá)，結(jié)合piRNAs類沉默TEs。WAGO蛋白在線蟲(chóng)內(nèi)參與獨(dú)特的RNAi系統(tǒng)。

果蠅的基因組含有五種AGO基因，包括兩個(gè)成員來(lái)自AGO分支（ago1和ago2）和三個(gè)成員來(lái)自PIWI分支（piwi，aub和ago3）。定位三種PIWI蛋白質(zhì)是很困難的。Aub和Ago3位于生殖細(xì)胞的細(xì)胞核周圍的電子聚集云團(tuán)中，而Piwi的主要位點(diǎn)是卵的生殖細(xì)胞和體細(xì)胞的細(xì)胞核。在卵發(fā)育過(guò)程中Piwi也位于細(xì)胞質(zhì)中。這三種PIWI蛋白有強(qiáng)烈的與piRNAs結(jié)合的偏好。piRNAs反義的TE轉(zhuǎn)錄本主要被Piwi和Aub結(jié)合，而piRNAs正義的TEs主要被Ago3結(jié)合。因?yàn)镈rosha和Dicer不參與piRNA通路，piRNAs的生物通路不同于miRNAs和內(nèi)源的siRNAs。piRNA生物起源是很復(fù)雜的并且具體的機(jī)制需進(jìn)一步的探究，但是已知Piwi，Aub和Ago3參與piRNA的生成，通過(guò)“Ping-Pong”模型來(lái)沉默目標(biāo)。

4.在果蠅中的piRNAs：a snapshot

在果蠅中，piRNAs是23-29nt的sRNAs，主要表達(dá)在生殖細(xì)胞中。第一個(gè)鑒定的piRNAs是重復(fù)相關(guān)的siRNASA（rasiRNAs），來(lái)自于the Y-linked Suppressor of Stellate位于D.melanogaster。這些piRNAs被發(fā)現(xiàn)是沉默the X-linked串聯(lián)重復(fù)的stellate基因。此后，piRNAs被發(fā)現(xiàn)作為主要的調(diào)節(jié)者來(lái)抑制果蠅中的TEs和其他模式生物，比如小鼠，大鼠，線蟲(chóng)和斑馬魚(yú)。piRNA的全部序列很復(fù)雜，上千個(gè)分離的piRNA序列存在于果蠅的基因組上。還有，不同的piRNAs的序列之間沒(méi)有結(jié)構(gòu)或者功能的相似，除了第一個(gè)核苷酸上的尿嘧啶這個(gè)很強(qiáng)的偏差外。在果蠅中，piRNAs通過(guò)完美或幾近完美的反義匹配來(lái)識(shí)別它們的靶標(biāo)，主要是活躍的TEs的mRNAs。piRNAs通過(guò)“Ping-Pong”循環(huán)來(lái)抑制它們的目標(biāo)mRNAs。

5.piRNA簇

piRNAs基因組水平的圖譜表明D.melanogaster中大部分piRNAs是來(lái)源于離散的位點(diǎn)，也被稱為piRNAs簇。只有小部分piRNAs來(lái)自于基因的區(qū)域，比如來(lái)自tj的3UTR。至少142個(gè)piRNAs簇被證實(shí)位于D.melanogaster的基因組上并且這些簇聚集在重復(fù)序列或者未激活的TE片段。piRNAs簇最高達(dá)200kb，并且它們偏好位于異染色體區(qū)域，此區(qū)域的特質(zhì)是在組蛋白H3的賴氨酸9的三甲基化（H3K9me3），并且組蛋白H3結(jié)合異染色體蛋白1（HP1）。這些異染色體區(qū)域通常不易重組，所以降低了單純選擇的有效性，此區(qū)域被認(rèn)為是TEs積累和發(fā)展成piRNA簇的“safe harbors”。所以，幾乎所有研究表明異染色體的形成對(duì)于piRNAs的正常生成至關(guān)重要。

基于成熟piRNAs的線性分布，piRNAS簇被分為“uni-strand”和“dual-strand”簇?！皍ni-strand”簇含有位于一個(gè)基因組線的piRNAs，比如flamenco簇位于X染色體并且長(zhǎng)達(dá)180kb，這是對(duì)應(yīng)于腺囊滿中的體細(xì)胞piRNAs（體細(xì)胞在生殖細(xì)胞周圍）?！皍ni-strand”piRNA簇可能被經(jīng)典RNA轉(zhuǎn)錄酶2（RNAP2）轉(zhuǎn)錄。比如，flamenco簇被Ci蛋白質(zhì)激活并且flamenco的轉(zhuǎn)錄本前體經(jīng)歷選擇性剪切后生成各種各樣的piRNA前體。可見(jiàn)一個(gè)P因子插入Flamenco的5末端會(huì)導(dǎo)致在此簇中的所有轉(zhuǎn)錄失敗。

“dual-strand”簇產(chǎn)生決大部分D.melanogaster基因組中的piRNAs，產(chǎn)生的piRNAs位于兩條鏈。“dual-strand”簇通常不展示RNAP2轉(zhuǎn)錄的標(biāo)記，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙倜鞔_的啟動(dòng)子，5甲基-尿嘧啶cap和明確的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，可能是異染色體蛋白R(shí)hino，Deadlock和轉(zhuǎn)錄終止輔因子Cutoff形成“RDC”復(fù)合物來(lái)介導(dǎo)雙鏈piRNA簇在果蠅卵中的轉(zhuǎn)錄。此外，Rhino，Cutoff和RNA解旋酶UAP56被要求來(lái)抑制前體轉(zhuǎn)錄本的剪接，為了piRNAs。并且，一個(gè)piRNAs簇的雙鏈的轉(zhuǎn)錄被要求為了形成piRNAs的正確產(chǎn)物。

6.初級(jí)piRNA的成熟

在卵泡細(xì)胞中，只有PiWi表達(dá)，沒(méi)有Aub或者Ago3。單鏈piRNA簇的轉(zhuǎn)錄本首先被轉(zhuǎn)錄到細(xì)胞質(zhì)中的Yb小體內(nèi)。位于線粒體外膜上的Zucchini（Zuc）剪切長(zhǎng)單鏈轉(zhuǎn)錄本，并且生成piRNA中間物。piRNA中間物的5末端被負(fù)載于生殖細(xì)胞Yb小體的Piwi上。明顯的piRNAs5端尿嘧啶偏差與Piwi的MID結(jié)構(gòu)域相互聯(lián)系。此外，piRNA的3末端被Nibler或者Trimmer和其PIWIs的輔因子修剪形成成熟的長(zhǎng)度。當(dāng)3末端的修剪停在被Piwi保護(hù)的piRNA中間物的區(qū)域，3末端被Hen1甲基化，形成成熟初級(jí)piRNAs的一個(gè)2-O-甲基化修飾。在生殖細(xì)胞中，成熟的初級(jí)piRNAs能夠以轉(zhuǎn)錄后的方式來(lái)識(shí)別和摧毀目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本。許多其他的蛋白質(zhì)也參與了卵泡細(xì)胞中初級(jí)piRNAs的成熟。這些蛋白質(zhì)包括Tudor protein Yb，Vreteno（Vret），Minotaur（Mino），Gasz，解旋酶Armitage（Armi），伴侶因子Shutdown（Shu），還有熱休克蛋白90（Hsp90），其中大部分都錨定在線粒體外膜上。

在生殖細(xì)胞中，Vasa和UAP56識(shí)別piRNA簇的轉(zhuǎn)錄本，并且將它們從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。在生殖細(xì)胞中，初級(jí)piRNA的處理與卵泡細(xì)胞中的機(jī)制類似，除了Piwi，Aub和Ago3都被表達(dá)， 但是只有Piwi和Aub負(fù)載成熟的初級(jí)piRNA。Aub負(fù)載的初級(jí)piRNA，與Ago3一起，通過(guò)一個(gè)“Ping-Pong”循環(huán)來(lái)產(chǎn)生次級(jí)piRNA。

7.“Ping-Pong”循環(huán)擴(kuò)增次級(jí)piRNA并且沉默靶標(biāo)基因

“Ping-Pong”循環(huán)是一個(gè)在生殖細(xì)胞TE抑制中很好的機(jī)制。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在“Ping-Pong”循環(huán)中，一個(gè)Ago3相關(guān)的piRNA識(shí)別一條互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄本（通常來(lái)自于活躍的TE），并且Ago3根據(jù)Ago3結(jié)合piRNA的10個(gè)堿基來(lái)剪切靶標(biāo)基因的位點(diǎn)，然后產(chǎn)生新的被Aub負(fù)載的piRNA。這個(gè)Aub負(fù)載的piRNA反過(guò)來(lái)又識(shí)別和剪切一條互補(bǔ)的TE轉(zhuǎn)錄本，產(chǎn)生一個(gè)與初始Ago3負(fù)載piRNA一樣的新piRNA。piRNA在“Ping-Pong”循環(huán)過(guò)程中被擴(kuò)增，產(chǎn)生在正義鏈和反義鏈之間10個(gè)堿基對(duì)的重疊序列?！癙ing-Pong”循環(huán)同時(shí)也消耗了TE的轉(zhuǎn)錄本，因此沉默了TE。

8.總結(jié)和展望

過(guò)去的十年，piRNA的發(fā)現(xiàn)革新了我們對(duì)TE沉默的分子機(jī)制的理解。piRNA和TE之間的相互作用很好地解釋了在果蠅I-R和P-M系統(tǒng)的雜交不育。在初級(jí)和次級(jí)piRNA生產(chǎn)過(guò)程中，有多種蛋白質(zhì)的參與，最重要的是PiWi、Aub和Ago3，并伴隨著“Ping-Pong”循環(huán)來(lái)擴(kuò)增次級(jí)piRNA。更多新的piRNA的生成是沉默相對(duì)應(yīng)TE的基礎(chǔ)。一些研究表明，piRNA與其蛋白復(fù)合物與TE特異性結(jié)合后，招募重塑蛋白、DNA甲基化蛋白、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)使TE沉默。

但是，一些基本的問(wèn)題亟待去進(jìn)一步的探究。從進(jìn)化的角度，為什么果蠅選擇了使用piRNA機(jī)制來(lái)抵抗TE？在piRNA生成和作用的過(guò)程中，哪些蛋白質(zhì)結(jié)合了piRNA，對(duì)piRNA起什么作用？piRNA如何識(shí)別TE，又如何沉默TE？回答這些問(wèn)題將毫無(wú)疑問(wèn)地幫助我們更好的理解有關(guān)piRNA的基本問(wèn)題，也將有助于從研發(fā)有關(guān)piRNA的應(yīng)用，比如對(duì)RNA的編輯、對(duì)基因的沉默調(diào)控等。