不同酸化劑對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌體外抑菌效果的影響

崔慶

摘 要：本試驗(yàn)旨在探討A酸、C酸和酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌體外抑菌效果的影響。試驗(yàn)選用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌三種常見(jiàn)致病菌作為指示菌，酸化劑A酸、C酸和酸無(wú)窮的濃度分別設(shè)置為0.4、0.5、0.7、0.9、1.1 g/mL，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，通過(guò)牛津杯法測(cè)定抑菌圈大小，來(lái)評(píng)估不同濃度水平A酸、C酸、酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的體外抑菌效果。結(jié)果表明：A酸、C酸和酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌均產(chǎn)生顯著的抑菌效果（P < 0.05），酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果顯著優(yōu)于A酸（P < 0.05），A酸和酸無(wú)窮對(duì)三種菌的抑菌效果均顯著優(yōu)于C酸（P < 0.05）；隨著酸化劑的濃度升高，酸化劑的抑菌效果顯著增強(qiáng)（P < 0.05）；不同濃度水平的酸化劑對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果差異顯著（P < 0.05）。1.1 g/mL酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最好（P < 0.05），1.1 g/mLA酸對(duì)沙門氏菌的效果最好（P < 0.05）。

關(guān)鍵詞：酸化劑；金黃色葡萄球菌；沙門氏菌；大腸桿菌；體外抑菌

前 言

使用抗生素具有殘留性和耐藥性等負(fù)面作用，為了維持養(yǎng)殖業(yè)高水平生產(chǎn)力，尋找抗生素替代物已成為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)問(wèn)題之一。

酸化劑安全、無(wú)污染、無(wú)殘留，能夠降低飼料和動(dòng)物胃腸道中的pH值，主要是由有機(jī)酸、鹽類和無(wú)機(jī)酸組成。不僅具有提高飼料利用率、改善動(dòng)物生產(chǎn)性能的作用，還具有抑制有害微生物的活動(dòng)和繁殖、促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，改善動(dòng)物胃腸道內(nèi)微生物區(qū)系，保護(hù)動(dòng)物胃腸道黏膜健康、增強(qiáng)動(dòng)物免疫機(jī)能等作用[1]，作為抗生素替代品在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中得到了廣泛應(yīng)用。

研究表明，在飼料中添加檸檬酸，大腸桿菌的數(shù)量減少，乳酸桿菌的數(shù)量增加，仔豬腹瀉率降低[10]。苯甲酸可以降低仔豬胃腸道pH值，并增加揮發(fā)性脂肪酸。富馬酸是三羧酸循環(huán)有氧過(guò)程的重要組分，能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)酶活性和能量代謝等一系列生化反應(yīng)[13]。雖然目前有很多關(guān)于不同有機(jī)酸之間以及有機(jī)酸和復(fù)合酸之間抑菌效果的比較研究，但是對(duì)于復(fù)合酸化劑之間的抑菌效果的比較研究很少。通過(guò)把有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸結(jié)合，利用酸化劑解離度不同，在幾種酸的協(xié)同作用下形成抑菌譜更廣的復(fù)合酸化劑，來(lái)達(dá)到增強(qiáng)抑菌效果的目的[11，5]。此外，還有研究表明，復(fù)合酸化劑的種類和配比不同，對(duì)仔豬腸道微生物區(qū)系的影響也會(huì)有所不同[2，4]。本研究選用不同配比的復(fù)合酸化劑A酸、C酸和酸無(wú)窮，選取金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌作為指示菌，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)評(píng)定3種復(fù)合酸化劑對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果，為不同復(fù)配酸化劑在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

A酸、C酸和酸無(wú)窮購(gòu)自四川建奇飼料有限公司，酸化劑成分組成見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)菌種

金黃色葡萄球菌（ATCC65213）、沙門氏菌（ATCC21512）和大腸桿菌（ATCC83912）來(lái)自西南民族大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試驗(yàn)儀器

BSA 124 S-CW電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；GHP-9270恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；牛津杯 內(nèi)徑（6.0±0.1）mm、外徑（7.8±0.1）mm（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；SW-CJ-2 FD無(wú)菌操作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；SYQ-DSX-280 B壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；THZ-98 C 恒溫?fù)u床機(jī)（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DHG-9140 A電熱恒溫鼓風(fēng)烘箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；UV 1810 S分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基的配制

瓊脂培養(yǎng)基的配制：取瓊脂3 g于錐形瓶中，加入超純水至200 mL，置于滅菌鍋在121 ℃條件下進(jìn)行滅菌15 min。

液體培養(yǎng)基的配制：取胰蛋白胨3 g、氯化鈉3 g、酵母粉1.5 g于錐形瓶中，加入超純水至300 mL，置于滅菌鍋121 ℃條件下進(jìn)行滅菌15 min。

固體培養(yǎng)基的配制：取胰蛋白胨3 g、氯化鈉3 g、酵母粉1.5 g、瓊脂4.5 g于錐形瓶中，加入超純水至300 mL置于滅菌鍋121 ℃條件下進(jìn)行滅菌15 min。

1.4.2 菌種的活化

從-70 ℃冰箱中取出冷藏的菌種，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌落到20 mL液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h。從第一次活化的菌液里取1 mL加到10 mL液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 h，用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定OD值，進(jìn)行第二次活化，對(duì)菌液的搖床活化進(jìn)行直至用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)量OD值達(dá)到0.5（0.45～0.55），記錄數(shù)據(jù)，作為指示菌。

1.4.3 酸溶液的制備

分別稱取0.16 g、0.20 g、0.28 g、0.36 g、0.44 g的A酸、C酸和酸無(wú)窮，用超純水稀釋至濃度依次為0.4、0.5、0.7、0.9、1.1 g/mL的酸溶液，隨后進(jìn)行水浴加熱，加熱后紫外滅菌備用。

1.4.4 抑菌試驗(yàn)

將滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，置于無(wú)菌操作臺(tái)冷卻凝固后，在無(wú)菌條件下放入經(jīng)過(guò)滅菌的牛津杯，輕輕按壓，使牛津杯穩(wěn)固。取指示菌液200 uL到滅菌后的液體培養(yǎng)基中搖勻，倒入穩(wěn)固牛津杯的瓊脂培養(yǎng)基中，待冷卻后取出牛津杯。分別加入100 uL的各個(gè)濃度的酸溶液，每一濃度下的酸溶液設(shè)置3個(gè)重復(fù)。隨后，置于GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱37 ℃下恒溫培養(yǎng)6～9 h，觀察出圈情況，待抑菌圈形成后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件分析，對(duì)不同酸化劑對(duì)三種菌抑菌效果的影響和不同濃度水平的酸化劑對(duì)三種菌抑菌效果的影響進(jìn)行二因素方差分析，對(duì)不同濃度水平的A酸、C酸和酸無(wú)窮對(duì)三種菌抑菌效果的影響分別進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法進(jìn)行多比較，結(jié)果采用平均值形式表示，其中P > 0.05表示差異不顯著，P < 0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

表2可知，A酸、C酸和酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果差異顯著（P < 0.05）；酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果顯著優(yōu)于A酸和C酸（P < 0.05），A酸對(duì)沙門氏菌的抑菌效果顯著優(yōu)于C酸和酸無(wú)窮（P < 0.05）；不同濃度的A酸、C酸和酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果差異顯著（P < 0.05），隨著濃度水平提高，酸化劑對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果增強(qiáng)（P < 0.05），濃度為1.1 g/mL時(shí)，酸化劑的抑菌效果最好；酸化劑種類和濃度二因素對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果有顯著的互作影響（P < 0.05），濃度水平為1.1 g/mL的A酸對(duì)沙門氏菌的抑菌效果最好（P < 0.05），濃度水平為1.1 g/mL的酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最好（P < 0.05）。

3 討論

致病性金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌可引起畜禽腸道等疾病，是危害養(yǎng)殖業(yè)的重要病原。酸化劑具有抑制有害微生物的活動(dòng)和繁殖、促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，改善胃腸道內(nèi)微生物區(qū)系，保護(hù)動(dòng)物胃腸道黏膜健康、增強(qiáng)動(dòng)物免疫機(jī)能等作用[1]。酸化劑的抑菌機(jī)制主要有兩個(gè)方面。第一，酸通過(guò)自由擴(kuò)散的方式進(jìn)入菌體細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)解離出的氫離子和酸根離子不能通過(guò)自由擴(kuò)散的方式跨膜，導(dǎo)致氫離子在胞內(nèi)集聚，細(xì)胞質(zhì)pH降低，迫使細(xì)菌通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸釋放細(xì)胞內(nèi)氫離子，恢復(fù)胞質(zhì)pH平衡，確保酶的作用，這個(gè)過(guò)程消耗大量ATP，與細(xì)菌正常生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生能量競(jìng)爭(zhēng)。酸根離子聚集，改變胞內(nèi)內(nèi)環(huán)境，并通過(guò)細(xì)胞遺傳信息傳遞干擾細(xì)菌的DNA合成、造成細(xì)菌代謝途徑發(fā)生改變、細(xì)胞的代謝活性受到抑制[6]，此外，由于細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，細(xì)胞必須釋放帶負(fù)電荷的離子，如細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的前體物質(zhì)來(lái)平衡胞內(nèi)滲透壓，從而抑制細(xì)菌正常生長(zhǎng)。第二，未解離的有機(jī)酸可以與菌體膜發(fā)生作用，破壞了菌體膜的完整性，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄，動(dòng)物胃腸道的pH值降低，病原菌的生長(zhǎng)環(huán)境受到破壞，從而達(dá)到抑菌目的[1]。

在本試驗(yàn)結(jié)果中，A酸、C酸和酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果均為顯著，驗(yàn)證了酸化劑的抑菌作用。其中，0.4 g/mL是A酸、C酸和酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度；隨著濃度的增加，抑菌圈越大，抑菌效果越明顯[9]。0.7 g/mL～1.1 g/mL時(shí)，A酸、C酸和酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌均有明顯的抑菌效果；1.1 g/mL是最佳的抑菌濃度。

酸化劑主要由無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸和鹽類組成。許多研究表明，將有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸混合可以產(chǎn)生互補(bǔ)協(xié)同效應(yīng)，將在不同pH范圍內(nèi)作用的幾種酸復(fù)合在一起，可以形成抑菌譜更廣的復(fù)合酸化劑，增強(qiáng)抑菌效果[11]。

在本試驗(yàn)中，A酸、C酸和酸無(wú)窮均為復(fù)合型酸化劑，雖然三種酸化劑的成分組成有所區(qū)別，但均對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌有顯著的抑菌效果。其中，苯甲酸對(duì)大多數(shù)微生物有抑制作用，在 pH值為5.0和5.5的條件下，高濃度的苯甲酸對(duì)大腸桿菌有明顯地抑制效果[3]。富馬酸是三羧酸循環(huán)有氧過(guò)程的重要組分，能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)酶活性和參與能量代謝等一系列生化反應(yīng)[13]，其作用機(jī)制主要是富馬酸穿過(guò)微生物細(xì)胞膜阻止DNA的合成來(lái)減少微生物菌群，或者抑制微生物的三羧酸循環(huán)來(lái)達(dá)到抑菌的目的，因此具有雙重抑菌效果[12，5]。檸檬酸能降低細(xì)胞間質(zhì)的pH，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[8]。利用酸化劑解離度存在差異，可以使用一些解離度大的酸來(lái)降低 pH，選擇一些解離度小的酸來(lái)抑菌，在幾種酸的協(xié)同作用下來(lái)達(dá)到抑菌的目的[5]，如苯甲酸屬于解離度大的酸，可降低溶液的 pH 值，富馬酸的解離度比較小，可有效協(xié)同抑菌。在此基礎(chǔ)上，A酸中的磷酸組分高于C酸和酸無(wú)窮，磷酸可以使飼料的pH值很快下降，增強(qiáng)抑菌效果，所以1.1 g/mL的A酸對(duì)沙門氏菌的抑菌效果最好；酸無(wú)窮在A酸和C酸成分組成的基礎(chǔ)上增加甲酸、乙酸和丙酸成分，揮發(fā)性有機(jī)酸通過(guò)消耗菌體ATP參與能量競(jìng)爭(zhēng)或者抑制DNA等生物大分子合成而發(fā)揮抑菌作用[7]，通過(guò)綜合幾種酸的抑菌機(jī)理，抑菌效果得到增強(qiáng)，所以1.1 g/mL的酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最好。

4 結(jié)論

A酸、C酸和酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌均產(chǎn)生顯著的抑菌效果，酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最優(yōu)，A酸對(duì)沙門氏菌的抑菌效果最好；隨著酸化劑的濃度升高，酸化劑的抑菌效果顯著增強(qiáng)；不同濃度的酸化劑對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的體外抑菌效果差異顯著；濃度為1.1 g/mL的酸無(wú)窮對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最好，濃度為1.1 g/mL的A酸對(duì)沙門氏菌的效果最好。

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（作者單位：西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院）