基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討石斛合劑治療糖尿病的作用機制

陳 濤，朱銘星，林詩鈴，陳劍鈺，張捷平，施 紅，黃鳴清，鄭燕芳*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

糖尿病患者以慢性高血糖為特征，繼發(fā)引起機體組織、細(xì)胞損傷［1］。石斛合劑是福建中醫(yī)藥大學(xué)施紅教授通過長期臨床實踐總結(jié)制定，并已成為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，由石斛、知母、黃芪、丹參、葛根、黃連、五味子、地龍、蒲公英、大黃等藥物組成，具有清熱、活血、祛毒之功效。前期臨床和基礎(chǔ)研究表明，石斛合劑治療糖尿病及其并發(fā)癥具有顯著療效，其作用可能與促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖、保護神經(jīng)系統(tǒng)等有關(guān)［2-3］。但由于石斛合劑成分復(fù)雜，很難從整體水平系統(tǒng)闡明其治療糖尿病及其并發(fā)癥的作用機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過“多成分-多靶點-多通路”模型顯示藥物和機體之間的聯(lián)系，以整體性與系統(tǒng)性為特性，符合中醫(yī)的整體觀念［4］。故本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘石斛合劑在治療糖尿病及其并發(fā)癥中潛在的有效成分和作用機制。

1 方 法

1.1 石斛合劑化學(xué)成分收集及潛在靶點預(yù)測 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//www.tcmsp-e.com/），以口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為有效成分ADME 篩選條件。同時通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、ETCM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.tcmip.cn/ETCM/）檢索石斛合劑組成中藥，篩選石斛合劑藥物成分。同時通過中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（CNKI）、PubMed 等網(wǎng)站對已有文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，篩選出同為石斛合劑的潛在活性成分作為補充。將石斛合劑活性成分整理去重后，通過PubChem 平臺（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取石斛合劑潛在活性成分的2D 結(jié)構(gòu)式，置入PharmMapper 平臺（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）中，進(jìn)行潛在靶點預(yù)測。選取各化合物潛在靶點評分中的前50 個靶點，并以UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）標(biāo)準(zhǔn)化靶點名稱。

1.2 糖尿病潛在作用靶點篩選及藥物-疾病共同作用靶點獲取 以“Diabetes Mellitus”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）檢索糖尿病相關(guān)靶點，將靶點的相關(guān)系數(shù)＞9.0為卡值，同時通過TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com/）進(jìn)行疾病靶點補充，合并去重，置入UniProt 數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化靶點名稱，獲得糖尿病相關(guān)靶點基因。將石斛合劑中藥物作用靶點與糖尿病相關(guān)靶點基因進(jìn)行映射，得到藥物-疾病共同作用靶點。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將糖尿病相關(guān)靶點基因映射到石斛合劑有效成分潛在靶點上，取兩者交集繪制韋恩圖，并導(dǎo)入STRING 平臺（https：//cn.string-db.org/）構(gòu)建PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。

1.4 GO 富集分析與KEGG 通路分析 利用DAVID平臺對石斛合劑-糖尿病的交集靶點進(jìn)行GO 富集分析與KEGG 通路分析，將富集分析結(jié)果利用微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）作圖后進(jìn)行可視化分析。

1.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將KEGG 富集分析得到的通路信息通過Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建成分-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)圖，對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，分析石斛合劑作用于糖尿病的主要活性成分?/p>

1.6 活性成分與靶點分子對接驗證 從PubChem數(shù)據(jù)庫下載主要活性成分的3D 結(jié)構(gòu)文件，利用OpenBabel-2.4.1 軟件將其轉(zhuǎn)化為MOL2 格式文件。選定PPI 網(wǎng)絡(luò)核心關(guān)鍵靶點，從PDB 數(shù)據(jù)庫下載核心靶點蛋白的PDB 格式文件，再利用PyMol 軟件對其進(jìn)行去除配體和水分子等操作。最后將得到的成分文件和靶點文件利用AutoDockTools 1.5.6 和AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對接，結(jié)合能越低，表示結(jié)合活性越強，通常認(rèn)為結(jié)合能＜0 kcal/mol 提示分子之間具有結(jié)合活性，＜-5.0 kcal/mol 提示分子之間具有較強的結(jié)合活性［5］。利用PyMol 軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1 石斛合劑的活性化合物篩選及靶點預(yù)測 通過TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，同時檢索文獻(xiàn)對化學(xué)成分進(jìn)行補充，最后共得到總有效成分199 個，通過PharmMapper 平臺進(jìn)行靶點預(yù)測，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一規(guī)范靶點名，刪除重復(fù)值，得到活性成分潛在靶點共291 個。石斛合劑藥物對應(yīng)的潛在活性成分及靶點數(shù)目，見表1。

表1 石斛合劑“中藥-活性成分-潛在靶點”信息

2.2 糖尿病有關(guān)靶點預(yù)測 通過GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫獲取糖尿病潛在疾病靶點1 030 個。將藥材與疾病靶點映射后，獲得74 個石斛合劑抗糖尿病的潛在作用靶點，繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 石斛合劑治療糖尿病靶點韋恩圖

2.3 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò) 經(jīng)STRING 平臺獲取石斛合劑抗糖尿病作用靶點的相互作用關(guān)系，通過Cytoscape 3.7.2 制作網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2 所示。包括73 個節(jié)點與551 條邊，按照度值從大到小排序，以度值、介數(shù)、緊密度的平均數(shù)為條件，篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的核心靶點，共獲得14 個核心靶點，包含白蛋白（ALB）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（Akt1）、促生長因子（IGF1）、表皮生長因子受體（EGFR）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、雌激素受體α（ESR1）、過氧化物酶體增生激活受體α（PPARA）、內(nèi)皮一氧化氮合成酶（NOS3）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）等，推測其在石斛合劑治療糖尿病中具有重要地位。

圖2 石斛合劑治療糖尿病的靶點基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 功能富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對靶點進(jìn)行GO 富集分析（P＜0.05），其中，生物過程（BP）相關(guān)條目179 條，生物過程主要涉及凋亡過程的負(fù)調(diào)控、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、細(xì)胞對胰島素的刺激反應(yīng)等生物過程；分子功能（MF）相關(guān)條目58 條，分子功能包括類固醇激素受體活性、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、藥物結(jié)合等；細(xì)胞組分（CC）相關(guān)條目16 條，細(xì)胞組成包括細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、胞外外泌體等部位。按照顯著程度進(jìn)行排名，篩選各排名前10 的結(jié)果，利用微生信網(wǎng)站繪制柱形圖，見圖3。

圖3 石斛合劑對于治療糖尿病的GO 富集分析

2.5 KEGG 通路分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對靶點進(jìn)行KEGG 富集分析（P＜0.05），共得到80 條通路及其有關(guān)信息，選定P值較小的前20 條顯著通路，利用微生信網(wǎng)站繪制氣泡圖，結(jié)果見圖4。KEGG結(jié)果中FoxO 信號通路、胰島素信號通路、PI3K/Akt信號通路等與糖尿病相關(guān)性較強，可能作為石斛合劑抗糖尿病的重要通路。

圖4 石斛合劑對于治療糖尿病的KEGG 富集分析

2.6 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 利用軟件Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建石斛合劑“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)圖由291 個節(jié)點，3 736 條邊構(gòu)成，見圖5。對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，以度值、介?shù)、緊密度的平均數(shù)作為核心成分篩選條件，共篩選得到39 個核心成分。核心成分包括表小檗堿（HL8）、新隱丹參酮Ⅱ（DS48）、小檗紅堿（HL7）、五味子乙素（WWZ11）、刺芒柄花素（D）、小檗堿（HL4）等。

圖5 石斛合劑的成分-靶點-通路圖

2.7 分子對接驗證 選取出PPI網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名前6 的核心靶點（ALB、Akt1、IGF1、EGFR、PPARG、ESR1）與成分-靶點-通路圖中核心成分度值排名前3 的表小檗堿、新隱丹參酮Ⅱ、小檗紅堿，利用AutoDock 軟件進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測，將活性成分與靶蛋白對接，發(fā)現(xiàn)除小檗紅堿與PPARG 對接結(jié)合能＞-5.0 kcal/mol 外其余結(jié)合能均＜-5.0 kcal/mol，見表2。將最佳對接構(gòu)象進(jìn)行PyMol 可視化結(jié)果展示，以表小檗堿為例，見圖6。

表2 石斛合劑治療糖尿病的核心成分與關(guān)鍵靶點的分子對接結(jié)果

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，石斛合劑可能通過FoxO 信號通路、胰島素信號通路、PI3K/Akt 信號通路等發(fā)揮對糖尿病的治療作用，通過對核心靶點與通路的分析，得出其主要通過調(diào)節(jié)胰島素敏感、降低胰島素抵抗、加速糖脂代謝等方式對糖尿病進(jìn)行調(diào)控，同時還可能對糖尿病的并發(fā)癥，如糖尿病認(rèn)知功能障礙、改善糖尿病骨骼肌萎縮等具有治療作用。

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析了石斛合劑成分潛在靶點與糖尿病靶點的交集靶點，得到了石斛合劑抗糖尿病的核心靶點，其中包括Akt1、IGF1、PPARG 等。其中Akt1 是Akt 基因的產(chǎn)物，被稱為Akt 激酶，在人體中具有調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的作用［6］。在機體缺乏胰島素時，Akt 可通過刺激胰島素反應(yīng)型葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4 向質(zhì)膜轉(zhuǎn)移，從而誘導(dǎo)細(xì)胞攝取葡萄糖［7］。IGF1 名為胰島素樣生長因子，在機體中可改善葡萄糖耐量與胰島素敏感性［8］。IGF1 還可通過IGF1/IGF1R 通路作用于甲狀腺激素，加速糖脂代謝［9］。PPARG 是一個來自配體激活核激素受體家族的轉(zhuǎn)錄因子，它在被激活時調(diào)節(jié)多種代謝途徑，包括脂質(zhì)生物合成和葡萄糖代謝［10］。在多項研究中，該靶點的激活與胰島素增敏和脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)直接相關(guān)［11-12］。在前期對于石斛合劑的研究中，其可以降低糖尿病大鼠血糖、甘油三酯、膽固醇水平，提高胰島素水平，提高組織攝取葡萄糖的能力，降低肝糖原的釋放，并調(diào)節(jié)Wnt 信號通路減少脂肪積累，促進(jìn)脂肪分解［13-14］。

圖6 分子對接模式圖

糖尿病腦病是糖尿病的一種常見并發(fā)癥，其常表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙［15］。Akt1 在人體中也具有調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的作用，有研究證明其可通過PI3K/Akt1/mTOR/CREB 通路對阿爾茨海默病大鼠淀粉樣蛋白損傷的海馬神經(jīng)元具有潛在的神經(jīng)保護作用［16］。PPARG 也具有重要的免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護作用［17］。因此，本研究預(yù)測，石斛合劑可作用于這些與代謝有密切相關(guān)的Akt1、IGF1 與PPARG 等靶點對糖尿病的糖脂代謝、胰島素抵抗等過程進(jìn)行干預(yù)，同時也可能通過PPARG 和Akt1 等靶點對其糖尿病腦病有起到治療作用。

FoxO 信號通路是治療糖尿病及其并發(fā)癥的通路之一。該通路的一個中心調(diào)節(jié)機制是由PI3K/Akt 途徑激活，從而影響胰島素通路［18］，改善糖脂代謝和胰島素抵抗［19］。同時還具有改善糖尿病心肌損傷［20］、改善糖尿病骨骼肌萎縮［21］、調(diào)控糖尿病認(rèn)知功能障礙［22］等作用。而Akt 作為PI3K/Akt 通路成員，經(jīng)研究證明在進(jìn)餐后分泌胰島素可激活該信號通路增加葡萄糖的利用，減少糖異生，調(diào)控PI3K/Akt 信號通路及其下游分子是糖尿病極有前景的治療靶點［23］。胰島素信號通路包括InsR/IRS-1通路或者直接獨立于IRS-1 激活RAS/MAPK 通路［24］。其中IRS-1 可通過PI3K/Akt 通路起到促進(jìn)胰島素影響葡萄糖代謝與脂質(zhì)代謝。胰島素抵抗是糖尿病的原因之一，而骨骼肌胰島素通路蛋白表達(dá)降低容易導(dǎo)致IR 的發(fā)生［25］。胰島素信號通路還可以通過InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4 影響骨骼肌對于葡萄糖的攝取，改善胰島素抵抗［26］。

通過成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖篩選出石斛合劑治療糖尿病核心成分包括表小檗堿、新隱丹參酮Ⅱ、小檗紅堿等，其中表小檗堿和小檗紅堿主要存在于黃連中，新隱丹參酮Ⅱ主要存在于丹參中。通過分子對接結(jié)果可知表小檗堿、新隱丹參酮Ⅱ、小檗紅堿與核心靶點對接關(guān)系良好。PI3K/Akt 信號通路在KEGG 富集分析結(jié)果中與多條通路作用有關(guān)，該通路起到調(diào)節(jié)胰島素分泌和血糖等作用，且分子對接結(jié)果顯示石斛合劑中核心成分之一的新隱丹參酮Ⅱ與該通路成員（Akt1、IGF1、EGFR、PPARG 等）具有較強的結(jié)合活性，可將該通路作為石斛合劑抗糖尿病的主要通路進(jìn)行深入研究。

糖尿病在中醫(yī)學(xué)上被稱為“消渴”，基本病機為陰津虧損、燥熱偏盛，而石斛合劑具有滋陰益氣、清熱潤燥、補腎活血的功效，方中石斛中潤胃陰，下滋腎陰，滋而不膩；黃芪氣陰雙補，利水消腫；丹參能夠通腎化瘀；知母和黃連清泄肺胃；五味子斂肺滋腎生津，寧心澀精；葛根升發(fā)脾胃清陽，生津止渴［27-28］。本實驗篩選結(jié)果表明，該方的核心成分主要存在于丹參、黃連和五味子中，它們能夠清泄肺胃、補腎化瘀、滋陰生津，在石斛合劑治療糖尿病中起到了重要作用，成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖篩選結(jié)果也證明了這點。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：石斛合劑可能基于FoxO 信號通路、胰島素信號通路、PI3K/Akt 信號通路等核心信號通路，以及調(diào)控Akt1、IGF1、PPARG等重要靶點之間相互協(xié)同作用，從而發(fā)揮治療糖尿病及其并發(fā)癥的作用。