正交試驗(yàn)優(yōu)選“桂枝與白芍”藥對煎煮工藝

陳永財(cái)，王彬輝，林 君

正交試驗(yàn)優(yōu)選“桂枝與白芍”藥對煎煮工藝

陳永財(cái)1，王彬輝2，林 君3

目的 優(yōu)選“桂枝與白芍”藥對最佳煎煮工藝。方法 以浸泡時(shí)間、武火沸后微火煎煮時(shí)間、加水量為因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交表，以芍藥苷含量、桂皮醛含量、浸膏得率為量化指標(biāo)，通過數(shù)據(jù)分析，優(yōu)選出最佳煎煮工藝。結(jié)果 最佳煎煮工藝為:浸泡時(shí)間60 min、武火沸后微火煎煮時(shí)間60 min、10倍加水量，其中加水量影響因素有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論 采用優(yōu)選后煎煮工藝操作簡便，穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，可控制煎出液內(nèi)在質(zhì)量，為“桂枝與白芍”藥對規(guī)范化煎煮提供合理的依據(jù)。

桂枝；白芍；正交試驗(yàn)；煎煮工藝；含量測定

0 引言

“桂枝與白芍”為典型的相制配伍，源于《傷寒論》的桂枝湯，為臨床常用的調(diào)和營衛(wèi)、溫通止痛藥對[1]。二者伍用桂枝湯(桂枝∶白芍為1∶1，以9～10 g為宜)，治太陽中風(fēng)表虛證；桂枝加芍藥湯(桂芍1∶2)治太陽病誤下傷中土虛木乘之腹痛；桂枝加桂湯(桂芍5∶3)治心陽虛弱寒氣凌心之奔豚[2]，可見保證核心“桂枝與白芍”藥對煎出液質(zhì)量尤為關(guān)鍵。依據(jù)傷寒論中“桂枝湯”煎煮方法：“以上五味，以水七升，微火煮取三升[2]”，提示“桂枝湯”采用微火久煎，其久煎時(shí)間、加水量多少，直接影響煎液內(nèi)在質(zhì)量，按傳統(tǒng)煎煮方法浸泡有利于有效成分溶出，故“桂枝與白芍”藥對煎煮時(shí)浸泡時(shí)間、微火久煎時(shí)間、加水量等三因素影響較為顯著[3-4]。本研究擬選用浸泡時(shí)間、微火煎煮時(shí)間、加水量因素，通過正交設(shè)計(jì)，以芍藥苷含量、桂皮醛含量、浸膏得率為量化指標(biāo)，對藥對煎煮工藝進(jìn)行優(yōu)選，控制煎出液內(nèi)在質(zhì)量，為“桂枝與白芍”藥對規(guī)范化煎煮提供合理的依據(jù)。

1 儀器與試劑

FL-1型可調(diào)式封閉電爐(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)，AB135-s型電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司)，F(xiàn)A2004B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，BC-119型電冰箱(杭州華日電冰箱股份有限公司)，島津LC-20AT高效液相色譜儀，RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器)，MODEL 0406-1離心機(jī)(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠)，甲醇、乙腈為色譜純(美國Merck公司)，乙酸為色譜純(浙江中星化工試劑有限公司)，水為超純水，其余試劑分析純。芍藥苷、桂皮醛對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號：110736-201438、110710-201418)。桂枝、白芍中藥飲片購自浙江華宇中藥飲片有限公司(批號：1503190、1505100)，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)熊耀康教授鑒定桂枝為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥嫩枝，白芍為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall)的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 芍藥苷、桂皮醛的含量測定[5]

2.1.1 色譜條件 Wonda Cract ODS-2色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈(A)-0.1%冰醋酸溶液(B)梯度洗脫，洗脫條件：0～10 min，13%～35%A；10～20 min，35%～60%A；20～25 min，60%A。流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長：254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取桂皮醛和芍藥苷對照品適量，加入甲醇溶解并分別定容至50、25 mL量瓶中，配制成含桂皮醛1.23 mg/mL、芍藥苷3.58 mg/mL的溶液。

2.1.3 供試品溶液制備及測定 按桂枝與白芍藥對(1∶1)稱取桂枝18 g、白芍18 g，加入定量水、浸泡一定時(shí)間，置于電爐上武火加熱煮沸后，改為文火(120 ℃電爐二擋)煎煮一定時(shí)間，煎煮一次濾過，即得，濾液加水稀釋定容至500 mL，精密稱取25 mL稀釋液，加入無水乙醇15 mL搖勻，于4 ℃冰箱靜置24 h,離心，上清液減壓回收溶劑至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解并定容至25 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，精密吸取10 μL注入液相色譜儀記錄峰面積值。見圖1。

圖1 桂枝白芍藥對HPLC

注：A.桂皮醛芍藥苷混合對照品，B.陰性對照，C.桂枝芍藥藥對；1.芍藥苷，2.桂皮醛

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密移取上述對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，各精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積。以峰面積(A)對濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得到芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=2.0×106C-2 998.1，R2=0.998 8，結(jié)果表明，芍藥苷進(jìn)樣量在0.071 6～1.145 6 mg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系；得到桂皮醛標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=7.0×106C-445.78，R2=0.999 3，結(jié)果表明，桂皮醛進(jìn)樣量在0.024 6～0.394 2 mg范圍內(nèi)與峰面積有良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取同一對照品溶液10 μL，按相同的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，結(jié)果顯示，芍藥苷的峰面積值分別為1 496 287、1 496 112、1 479 678、1 496 320、1 503 269、1 563 230，RSD值為1.94%，桂皮醛的峰面積值分別為184 492、186 871、187 719、187 581、185 696、187 188，RSD值為0.67%，表明本方法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號的飲片樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行測定，計(jì)算桂皮醛、芍藥苷含量。結(jié)果6份樣品桂皮醛分別為2.222、2.199、2.238、2.252、2.186、2.243 mg/g，芍藥苷含量分別為14.037、13.952、13.876、14.259、14.199、14.311 mg/g，桂皮醛、芍藥苷含量的RSD值分別為1.17%、1.25%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.1.7 回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取已知桂皮醛、芍藥苷成分含量的樣品溶液6份，分別精密加入相同量混合對照品，按“2.1.4”項(xiàng)下方法操作，依法測定。結(jié)果見表1，計(jì)算得桂皮醛、芍藥苷平均回收率為 92.92%、93.21%，RSD值為2.50%、2.01%。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液6份，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，分別記錄芍藥苷、桂皮醛的峰面積值。計(jì)算得芍藥苷的含量為15.35、15.23、15.11、15.40、15.34、15.35 mg/g，RSD值為0.70%；桂皮醛的含量2.93、2.92、2.92、2.92、2.92、2.93 mg/g，RSD值為0.17%。結(jié)果表明，溶液在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2 單因素試驗(yàn)考察 為考察“桂枝與白芍”藥對最佳傳統(tǒng)煎煮工藝，在查閱中藥煎煮相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素考察，以合煎液中桂皮醛、芍藥苷成分含量為主要指標(biāo)，同時(shí)按照2015版《中華人民共和國藥典》四部浸出物測定法[6]，測定浸出物含量，每份樣品平行3份。

表1 供試品中桂皮醛、芍藥苷的回收率(n=6)

2.2.1 控制微火考察 武火煮沸后，分別選取微火(110 ℃電爐一檔、120 ℃電爐二檔、130 ℃電爐三檔)及武火(150 ℃電爐四檔)。稱取桂枝18 g、白芍18 g，加入10倍量水，浸泡60 min，煎煮60 min，按“2.1.3”項(xiàng)制備供試品溶液，測定芍藥苷含量分別為14.32、17.35、15.17、12.39 mg/g，桂皮醛含量分別為3.21、3.35、2.85、1.39 mg/g，浸膏得率分別為6.78%、7.94%、7.35%、5.46%，結(jié)果表明，控制微火(120 ℃電爐二檔)效果最好。

2.2.2 浸泡時(shí)間考察 分別選取浸泡15、30、60、90 min，加入10倍量水，控制微火(120 ℃電爐二檔)煎煮60 min，按“2.1.3”項(xiàng)制備供試品溶液，測定芍藥苷含量為15.85、16.94、17.52、16.45 mg/g，桂皮醛含量為2.85、3.39、3.48、3.24 mg/g，浸膏得率為6.84%、7.95%、8.22%、7.43%，結(jié)果表明，浸泡60 min效果最理想。

2.2.3 煎煮時(shí)間考察 加入10倍量水，浸泡60 min，控制微火(120 ℃電爐二檔)，分別選取煎煮15、30、60、90 min，按“2.1.3”項(xiàng)制備供試品溶液，測定芍藥苷含量為14.63、16.54、17.29、15.84 mg/g，桂皮醛含量為2.65、3.21、3.52、2.96 mg/g，浸膏得率為7.63%、8.29%、8.32%、7.94%，結(jié)果表明，微火煎煮60 min最佳。

2.2.4 加水量考察 分別選取加水量5、6、7、8、10倍，浸泡60 min，控制微火(120 ℃電爐二檔)，煎煮60 min，按“2.1.3”項(xiàng)制備供試品溶液，測定芍藥苷含量為9.35、11.31、13.89、15.32、17.63 mg/g、桂皮醛含量為1.47、1.83、2.35、2.86、3.58 mg/g，浸膏得率為4.53%、5.21%、6.85%、7.13%、8.32%，結(jié)果表明，加水量對芍藥苷、桂皮醛含量和浸膏得率基本呈上升趨勢，因此加水量10倍為最好。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)首先要控制微火(120 ℃電爐二檔)保持微沸狀態(tài)下，選用浸泡時(shí)間(30、60、90 min)，微火煎煮時(shí)間(30、60、90 min)三水平較合理，加水量影響因素最顯著，考慮實(shí)際煎出量問題選用(5、7、10倍)三水平較恰當(dāng)。以上述三因素三水平作為考察對象，以藥對芍藥苷含量、桂皮醛含量、浸膏得率為量化指標(biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)，其各因素水平見表2，稱取桂枝18 g、白芍18 g (1∶1)，分別按L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表所列條件，按“2.1.3”項(xiàng)制備供試品溶液，測定芍藥苷、桂皮醛含量和浸膏得率，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表3。

表2 考察因素及水平

表3 正交實(shí)驗(yàn)表L9(34)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 本次實(shí)驗(yàn)對桂芍藥對的芍藥苷、桂皮醛2個(gè)有效成分，結(jié)合其提取浸膏得率同時(shí)進(jìn)行分析，對所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果見表4～表6。

表4 芍藥苷含量的方差分析

表5 桂皮醛含量的方差分析

表6 浸膏得率的方差分析

電爐武火加熱煮沸后改為文火(120 ℃電爐二檔)煎煮D項(xiàng)作為誤差項(xiàng)，由表4可知，加水量對芍藥苷含量有顯著差異(P<0.05)，且C>B>A，即選擇A2B2C3；由表5可知，加水量對桂皮醛含量有顯著差異(P<0.01)，且C>A>B，即選擇A2B2C3；由表6可知，加水量對浸膏得率有顯著差異(P<0.05)，且C>A>B，即選擇A2B1C3。由于B因素在浸膏得率影響很小，所以選擇A2B2C3為煎煮最佳優(yōu)選條件。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按A2B2C3煎煮工藝制備3批樣品，測得浸出物平均得率7.844%±0.141%，芍藥苷、桂皮醛含量的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(17.29±0.05)、(3.45±0.01) mg/g。各樣品測定結(jié)果見表7。結(jié)果表明，優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性較高。

3 討論

傷寒論中“桂枝湯”[2]煎煮方法：“以上五味，以水七升，微火煮取三升”，東漢1兩為15.6 g，1升為200 mL[7-8]，藥物總質(zhì)量約201 g，加水量1 400 mL，其煎出液為600 mL，煎出量與加水量比率為42.85%。表3中2號實(shí)驗(yàn)(浸泡30 min、微火煎煮60 min、7倍加水量252 mL)一次煎出液120 mL，煎出量與加水量比率為47.61%，可知2號實(shí)驗(yàn)煎煮工藝與東漢煎煮工藝基本吻合，按優(yōu)選最佳煎煮工藝(浸泡時(shí)間60 min、微火煎煮60 min、10倍加水量)一次煎出液250 mL，其煎出量與加水量比率為69.41%。優(yōu)選最佳工藝煎液質(zhì)量優(yōu)于2號實(shí)驗(yàn)，因此，優(yōu)選最佳煎煮工藝制備湯劑內(nèi)在質(zhì)量優(yōu)于古人制備湯劑。

表7 樣品含量及浸膏得率測定結(jié)果

桂枝含揮發(fā)油0.2%～0.9%，油中主含桂皮醛70%～80%，其主要藥理作用包括解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗病毒、抗菌等[9]。白芍的主要成分芍藥苷，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能作用[10]。桂皮醛不溶于水，隨水蒸氣的耗散而損失。實(shí)驗(yàn)表明，桂枝揮發(fā)油中桂皮醛在煎煮10 min時(shí)煎出量達(dá)到最大值[11]，提示桂皮醛隨著煎煮時(shí)間延長或武火煎煮其損失量必定增加，當(dāng)武火短時(shí)間煎和微火久煎耗水量相等時(shí)，其損失揮發(fā)油是相等的，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)微火久煎60 min時(shí)，煎液中桂皮醛含量最高，表明微火久煎有利于桂皮醛溶出，減少揮發(fā)油散失。芍藥苷溶于水，實(shí)驗(yàn)表明，芍藥苷隨著煎煮時(shí)間的延長而煎出量不斷增加，煎煮60 min時(shí)，煎出量達(dá)到峰值而后下降[11]，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了微火久煎60 min時(shí)，煎出含量達(dá)到峰值，因此“桂枝與白芍”藥對煎煮方法和“桂枝湯”微火久煎[12]相吻合，具有一定科學(xué)道理。

按藥典規(guī)定，桂枝切厚片，白芍切薄片，其質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，要有較長時(shí)間充分浸泡，使飲片潤脹，有利于有效成分滲透擴(kuò)散，但浸泡時(shí)間不宜過久，以免引起藥物酶解等。本研究證實(shí)，浸泡60 min，提取桂皮醛、芍藥苷含量最高。加水量的多少，直接影響湯劑質(zhì)量，本研究顯示，加水量影響因素有顯著差異(P<0.05)，藥多水少有效成分浸提不完全，藥少水多雖能增加有效成分的溶出量，可湯液量過大不利于患者服用，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，加水量10倍時(shí)，湯劑中桂皮醛、芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到峰值，浸膏得率提高。

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳煎煮工藝，既符合傷寒論中“桂枝湯”煎煮方法，又提高了煎液內(nèi)在質(zhì)量，為后期“桂枝與白芍”藥對體內(nèi)外研究奠定基礎(chǔ)。

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Optimization of decoction process of herbal pair of Ramulus cinnamomi and Radix Paeoniae Alba by orthogonal test

CHEN Yong-cai1,WANG Bin-hui2,LIN Jun3

(1.Wenzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wenzhou 325000,China;Medical College Affiliated Hospital of Taizhou University,Taizhou 318002,China;Zhejiang Hua Yu Pharmaceutical Co.,Wenzhou 325000,China)

Objective To optimize the best decoction process of herbal pair ofRamuluscinnamomiandRadixPaeoniaeAlba.Methods The L9(34) orthogonal table was designed with immersion time,high-heat micro-fire decoction time after boiling and added water as the factors,and paeoniflorin content,cinnamic aldehyde content and extract yield as the quantitative indicators.The best decoction process was optimized through data analysis.Results The optimal decoction technology was as follows:the immersion time was 60 min,micro-fire decoction time after high-heat boiling was 60 min,and 10 times of water should be added;the factor of added water had significant difference (P<0.05).Conclusion The optimized decoction process is simple,stable and feasible with good repeatability.It can control the inner quality and provide a reference for improving the quality control ofRamuluscinnamomiandRadixPaeoniaeAlba.

Ramuluscinnamomi;RadixPaeoniaeAlba;Orthogonal test;Decoction process;Content determination

2015-12-27

1.溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州 325000；2.臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬市立醫(yī)院，浙江 臺州 318002；3.浙江華宇藥業(yè)，浙江 溫州 325000

浙江省中醫(yī)藥項(xiàng)目(2015ZA195)；溫州市科委資助項(xiàng)目(Y20140746)

10.14053/j.cnki.ppcr.201612021